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Gradient to sectioning CUBE workflow pour la génération et l'imagerie d'organoïdes avec différenciation localisée
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Gradient to sectioning CUBE workflow pour la génération et l'imagerie d'organoïdes avec différenciation localisée

Jul 24, 2023

Communications Biology volume 6, Article number: 299 (2023) Citer cet article

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Les progrès de la culture organoïde ont conduit à divers mini-organes in vitro qui imitent les tissus natifs à bien des égards. Pourtant, le goulot d'étranglement reste pour générer des organoïdes complexes avec une structuration de l'axe du corps, ainsi que pour maintenir l'orientation des organoïdes pendant les processus d'analyse post-expérience. Ici, nous présentons un flux de travail pour la culture d'organoïdes avec un gradient de morphogène à l'aide d'un dispositif de culture CUBE, suivi de la section d'échantillons avec le CUBE pour conserver des informations sur la direction du gradient. Nous montrons que les sphéroïdes hiPSC cultivés avec deux milieux de différenciation séparés aux extrémités opposées du CUBE ont entraîné des expressions localisées des marqueurs de différenciation respectifs, contrairement à la distribution homogène des marqueurs chez les témoins. Nous décrivons également les processus de cryo et de paraffine sectionnant des sphéroïdes dans CUBE pour conserver les informations d'orientation du gradient. Ce flux de travail de la culture en gradient à la section avec CUBE peut fournir aux chercheurs un outil pratique pour générer des organoïdes de plus en plus complexes et étudier leurs processus de développement in vitro.

Les cellules souches pluripotentes (PSC) et les organoïdes qui en sont dérivés offrent un moyen pragmatique de modéliser et d'étudier la formation de tissus et d'organes au début du développement humain, car les spécimens réels posent des problèmes éthiques difficiles1,2,3,4. Les protocoles pour générer les divers organoïdes qui imitent les tissus natifs reposent généralement sur la manipulation séquentielle de l'activation ou de l'inhibition des voies de signalisation telles que Nodal, Hedgehog, Notch, Wnt ou BMP à différents moments pour induire une différenciation vers des lignées spécifiques, comme dans la génération d'organoïdes intestin5, rein6 et poumon7, épiblastes8,9 et gastruloïdes10.

Néanmoins, contrôler la croissance et la différenciation des cellules le long d'un axe corporel reste un défi dans les cultures d'organoïdes 3D. La structuration in vitro, antéro-postérieure et dorsale-ventrale des organoïdes peut résulter d'une auto-organisation cellulaire11,12, ou être obtenue en fusionnant des organoïdes différenciés séparément sous forme d'assemboïde, comme dans les organoïdes cérébraux avec différentes régions du cerveau ou les organoïdes biliaires avec des composants du foie, des voies biliaires et du pancréas13,14. La limitation de ces méthodes, cependant, est que parce que les cellules sont cultivées dans un seul milieu uniforme, le niveau de contrôle en termes d'informations spatiales fournies aux cellules est assez faible ; toutes les cellules du groupe de cellules qui composent l'organoïde reçoivent les mêmes signaux de différenciation des molécules de signalisation du milieu. In vivo, d'autre part, les gradients de concentration de morphogènes provenant d'autres sources contribuent également à déterminer où vont les cellules et quel phénotype ou modèle elles doivent adopter au cours du développement15,16. Par exemple, la formation du tube neural dépend des signaux de la notochorde et de la couche d'ectoderme non neuronal17, et les néphrons du rein se développent par échange de divers signaux entre le bourgeon urétéral et le mésenchyme métanéphrique18. Ainsi, il est nécessaire de répliquer les gradients de morphogènes afin de générer des organoïdes qui ressemblent plus étroitement aux tissus natifs in vivo.

Plusieurs technologies d'ingénierie ont été développées pour imiter la fourniture d'un gradient spatial de molécules de signalisation aux cellules in vitro. Les PSC conçues pour exprimer Sonic Hedgehog (Shh) 19 ou des billes d'agarose imbibées de morphogènes 20 peuvent être placées à proximité de l'organoïde en développement et la diffusion de molécules de la source aux cellules en différenciation a créé un gradient de concentration élevé à faible de morphogènes. De plus, divers transwells et microdispositifs modifiés qui permettent aux cellules d'être cultivées avec deux compartiments de médias séparés ont également été développés pour générer des gradients de morphogène dans des directions opposées à travers les cellules21,22,23,24,25,26. Cependant, ces technologies ne sont pas sans inconvénients : (1) elles nécessitent des procédures de préparation et de configuration compliquées qui ne sont pas faciles à réaliser dans la plupart des laboratoires de biologie sans compétences et équipements spécialisés, (2) elles manquent de contrôle sur le placement et le positionnement de l'échantillon dans l'appareil, et (3) il est difficile de récupérer l'échantillon de l'appareil après l'expérience pour d'autres analyses sans causer beaucoup de dommages à l'échantillon ou perdre l'orientation de l'échantillon. En particulier, la capacité à conserver des informations sur l'orientation du gradient auquel les cellules ont été soumises est essentielle pour assurer une analyse correcte de l'échantillon.

Nous avons donc cherché à résoudre ces problèmes en développant une plate-forme de culture de gradient simple et facile à utiliser pour contrôler la différenciation des PSC en organoïdes avec des modèles localisés distincts, tout en conservant l'intégrité de l'échantillon et l'orientation du gradient pour les processus d'analyse d'imagerie. Pour ce faire, nous utilisons un dispositif de culture CUBE précédemment développé pour améliorer la capacité de manipulation des échantillons cultivés dans l'hydrogel ECM et la répétabilité de l'ensemencement cellulaire et de la formation de motifs27,28. En raison de la simplicité du dispositif CUBE qui comprend un simple cadre en matériau dur avec des parois transparentes qui permettent la visibilité de l'échantillon à l'intérieur, la conception et la composition du CUBE peuvent être facilement adaptées pour répondre aux exigences de l'expérience. Par exemple, dans cette étude, la conception du cadre a été modifiée pour assurer l'étanchéité à l'eau intégrée à un dispositif fluidique, et le matériau du cadre choisi pour être compatible avec les réactifs organiques utilisés dans le traitement des échantillons post-expérience. Ici, nous montrons d'abord comment nous pouvons positionner avec précision les sphéroïdes de cellules iPSC dans la position souhaitée dans le CUBE. Ensuite, nous démontrons la facilité avec laquelle le gradient peut être généré dans le CUBE pour induire une différenciation localisée des CSPi simplement en le transférant sur un dispositif à puce à gradient à deux compartiments sans avoir besoin de mettre en place des systèmes de pompe compliqués. Enfin, nous présentons la compatibilité de la plate-forme de gradient avec différentes méthodes de traitement post-expérience (coupe cryo et paraffine) pour l'imagerie et l'analyse tout en conservant les informations d'orientation du gradient (Fig. 1). Avec ce flux de travail Gradient-in-CUBE, des organoïdes avec une différenciation contrôlée de l'axe du corps peuvent être obtenus, fournissant des modèles in vitro de plus en plus complexes dans lesquels nous pouvons systématiquement appliquer et étudier les effets des gradients de morphogènes dans la direction de la différenciation et du développement cellulaires dans les tissus, les organes et éventuellement les systèmes corporels pour approfondir notre compréhension des processus de développement chez l'homme.

Le concept de ce travail était d'utiliser le dispositif de culture CUBE pour contrôler d'abord la position d'ensemencement des cellules à l'emplacement souhaité, b puis transférer le CUBE sur une puce Gradient-in-CUBE pour cultiver des cellules avec un gradient de morphogène, et c enfin sectionner l'échantillon avec le CUBE pour maintenir les informations d'orientation du gradient dans les sections.

Les gradients de signalisation morphogène contribuent à la spécification et à la structuration du destin cellulaire dans les tissus en développement29, et la récapitulation de ce phénomène in vitro pourrait favoriser le développement de modèles d'organoïdes de plus en plus complexes. Cependant, la différenciation par des signaux de gradient est difficile à réaliser dans les organoïdes qui sont cultivés dans un seul milieu uniforme dans une plaque à puits et reposent principalement sur l'auto-organisation pour la structuration30. Bien qu'il y ait eu de nombreux rapports sur les méthodes de culture des organoïdes avec des gradients de morphogènes19,20,31, la configuration compliquée et la mauvaise capacité de manipulation des échantillons, ainsi que le maintien de l'orientation du gradient pendant l'analyse, limitent leur adoption généralisée par la communauté des organoïdes. En tirant parti de la capacité de manipulation facile du dispositif CUBE, nous avons établi un flux de travail allant de la culture d'organoïdes avec un gradient de morphogène à des échantillons d'imagerie avec une orientation de gradient, avec les processus suivants : (1) contrôler la position d'ensemencement initiale des cellules dans le CUBE qui permettent aux cellules de recevoir des informations de gradient cohérentes dans chaque expérience, (2) générer un gradient de signalisation de morphogène le long d'un axe de l'échantillon de cellules, et (3) sectionner l'échantillon avec le CUBE pour conserver les informations de la direction du gradient.

Le placement précis des cellules dans le CUBE est important pour assurer la cohérence de la signalisation de gradient que les cellules reçoivent. Par exemple, les informations de gradient détectées par les cellules placées trop près d'une extrémité du CUBE seront différentes de celles détectées par les cellules au centre du CUBE. Pour contrôler la position d'ensemencement des cellules dans le CUBE, un capuchon de moule avec une structure de pilier pour créer une poche d'ensemencement à la position souhaitée dans l'hydrogel dans le CUBE, ainsi que des rainures pour assurer l'ajustement précis du capuchon de moule sur le CUBE a été conçu (Fig. 2b(i)). Le processus de fabrication d'une poche d'ensemencement et de sphéroïdes de cellules de semence dans la poche est illustré à la Fig. 2b (ii) et décrit dans la section méthodes. En utilisant cette méthode d'ensemencement, les cellules peuvent toujours être ensemencées à l'emplacement souhaité avec une faible variation, par rapport au positionnement manuel des cellules sans guide, ce qui entraîne un ensemencement inexact avec une forte variation (Fig. 1 supplémentaire). Bien que l'on puisse affirmer qu'une personne hautement qualifiée ou un robot peut être en mesure de positionner des cellules dans le gel non durci avec une grande précision sans avoir besoin du capuchon de moule, le comportement de gélification des hydrogels mous tels que le collagène ou le Matrigel peut varier beaucoup en fonction de la température et de la manipulation de l'échantillon, et il est difficile de prédire quand le gel aura suffisamment polymérisé pour maintenir les cellules en position. Pour souligner la facilité avec laquelle cette méthode peut être utilisée par n'importe qui, nous avons recruté notre secrétaire de laboratoire et un élève du premier cycle du secondaire, qui n'avaient aucune expérience de l'utilisation du CUBE ou du capuchon de moule, pour effectuer la même expérience. Avec une formation minimale, les deux ont réussi à ensemencer avec une précision similaire à celle d'un utilisateur expérimenté et avec une précision nettement supérieure à celle d'un utilisateur expérimenté sans le capuchon du moule (Fig. 1 supplémentaire).

a Processus de fabrication CUBE (i) Conceptions CUBE pour la paraffine et la cryosection. (ii) Processus pour faire adhérer les parois latérales PDMS au dispositif CUBE. b Processus d'ensemencement des cellules (i) Conception du capuchon du moule. (ii) Processus pour ensemencer les cellules dans la poche d'ensemencement créée par le bouchon de moule dans l'hydrogel dans le CUBE. c Processus de fabrication Gradient-in-CUBE (i) Conceptions de moules pour fabriquer le couvercle et la base de la puce. (ii) Processus de fabrication de puces PDMS à partir de moules et collage du couvercle à la base par NSD, un joint adhésif PDMS double face. d Sectionnement pour l'imagerie. (i) Processus pour incorporer des échantillons dans un milieu cryogénique et sectionnement avec CUBE. (ii) Processus pour incorporer les échantillons dans de la paraffine avec le support CUBE, puis sectionner avec un bord marqué pour maintenir l'orientation de l'échantillon.

Pour établir un gradient sur toute la longueur du CUBE, une puce Gradient-in-CUBE, comprenant un composant de base et un composant de couvercle, a été conçue et fabriquée par un processus de moulage. Le moule de la base contenait un compartiment pour le CUBE et deux chambres de média séparées, ainsi qu'une rainure pour s'adapter au joint torique ; le moule pour le couvercle a deux orifices pour ajouter du milieu aux deux chambres de milieu séparées (Fig. 2c(i)). Les processus de fabrication de la puce sont illustrés sur la figure 2c (ii), (iii) et décrits dans la section des méthodes, avec un film supplémentaire 1 montrant comment le CUBE est intégré à la puce.

Le FITC-dextran et le TRITC-dextran ont été utilisés pour simuler l'ajout de deux types de médias différents au CUBE, et une imagerie quotidienne a été réalisée pour surveiller la progression de la formation du double gradient dans le CUBE sur une période de 5 jours (Fig. 3a). La concentration moyenne (C) de FITC et de TRITC dans la région centrale de la fenêtre du CUBE (x - x ') a été mesurée et a montré un gradient opposé de concentration élevée du côté source à une concentration plus faible du côté puits, car les molécules de dextrane respectives se déplacent du côté où elles sont fortement concentrées vers le côté opposé où la concentration est beaucoup plus faible (Fig. 3b). 10 μM de dextrane ont été ajoutés au réservoir source et la concentration maximale moyenne à l'extrémité source du FOV était FITC = 2,618 μM et TRITC = 3,255 μM, tandis que le minimum à l'extrémité du puits était FITC = 0,024 μM et TRITC = 0,026 μM. Le gradient a été calculé comme le rapport de Ix0, 2 / Ix2, 0 pour FITC et Ix2, 0 / Ix0, 2 pour TRITC, où une valeur de un ne montre aucun gradient et un rapport plus élevé représente un gradient plus raide (Fig. 3c). La pente du gradient augmente et culmine au cours des 24 premières heures lorsque les molécules commencent à pénétrer dans le gel, mais comme les molécules s'accumulent dans le côté opposé ainsi que dans le gel dans le CUBE, la pente du gradient diminue au jour 2. Néanmoins, avec un rinçage quotidien avec du DPBS et un remplacement par du dextran frais, un gradient constant peut être maintenu pendant 5 jours sans que le support n'atteigne un état d'équilibre. Dans cette étude, seule la diffusion de 40 kDa dextran dans un gel d'agarose a été utilisée pour modéliser la diffusion des facteurs de croissance dans un hydrogel ECM. Ceux-ci ont été choisis sur la base que le poids moléculaire de Wnt, qui joue un rôle de signalisation important dans le développement, est d'environ 40 kDa, et que le dextrane et l'agarose sont des réactifs facilement disponibles qui ont été utilisés dans de nombreuses études de transport de masse et de diffusion. En raison du grand nombre de gradients de morphogène connus avec des poids moléculaires variables et du vaste choix d'hydrogel disponible à utiliser dans la culture cellulaire, il n'était pas plausible d'étudier les différentes permutations d'appariements de morphogène et d'hydrogel dans la présente étude.

a Imagerie du gradient FITC et TRITC-dextran se formant sur une période de cinq jours. L'imagerie a été réalisée toutes les 24 heures après le retrait du dextrane utilisé, la chambre de milieu lavée avec du DPBS et du dextrane frais ajouté à la chambre. Les dimensions de la fenêtre du CUBE étaient w = 2,75 mm ; h = 3,5 mm et le champ de vision d'imagerie à un grossissement 4x était w = 3,6 mm ; h = 2,7 mm. Barre d'échelle = 1 mm. b La concentration, C a été déterminée en corrélant linéairement l'intensité moyenne le long de l'axe y pour chaque pixel dans la région centrale (w = 2,2 mm ; h = 2,2 mm) de l'image de fluorescence de x à x' à celle obtenue à partir d'un ajustement de courbe standard des concentrations de FITC et de TRITC-dextran. Barre d'échelle = 1 mm. Les marqueurs représentent des points de données sélectionnés tous les 50 pixels (~0,3 mm) et les lignes affichent le meilleur ajustement des moindres carrés linéaires ; n = 5. Les pentes des lignes individuelles pour FITC étaient de −0,0044 pour le jour 0, −0,5586 pour le jour 1, −0,5607 pour le jour 2, −0,5549 pour le jour 3, −0,5487 pour le jour 4 et −0,5391 pour le jour 5. Pour le TRITC, les pentes étaient de 0,0095 pour le jour 0, 0,7644 pour le jour 1, 0,7062 pour le jour 2, 0,6504 pour le jour 3, 0,5897 pour le jour 4 et 0,6039 pour le jour 5. Le jour 0 montre peu de gradient, mais au jour 1, un gradient de concentration est généré d'une extrémité du CUBE à l'extrémité opposée pour FITC et TRITC, respectivement, dans la direction opposée. c Le rapport entre la concentration à l'extrémité source et la concentration à l'extrémité puits a été pris comme une représentation de la pente du gradient. La zone analysée était de x = 0,2 mm à x = 2,0 mm comme la région approximative dans laquelle le sphéroïde serait situé. La pente était à son maximum le jour 1, mais bien que la pente ait diminué à partir du jour 2, une pente peut être maintenue de manière constante pendant cinq jours. d La différenciation du sphéroïde hiPSC avec le milieu induisant le mésoderme (M) d'un côté et le milieu induisant le neuroectoderme (NE) de l'autre côté donne un sphéroïde avec une morphologie différente à chaque extrémité du sphéroïde, alors que la morphologie est relativement uniforme chez les contrôles M ou NE uniquement. Barre d'échelle = 500 μm.

Étant donné qu'un gradient sur une échelle d'une seule ou de quelques cellules est suffisant pour fournir des informations de position aux cellules32,33, nous avons postulé que le gradient généré dans la puce Gradient-in-CUBE devrait être suffisant pour induire une différenciation localisée aux extrémités opposées d'un sphéroïde. De plus, une autre stratégie pour contrecarrer l'accumulation de morphogène consiste à compléter les inhibiteurs du morphogène du côté opposé du gradient, car l'interaction entre le morphogène et son inhibiteur est également essentielle pour la structuration dans les tissus in vivo. Par exemple, les antagonistes Wnt et Nodal Dkk1, Lefty-1 et Cer-1 dans les parties antérieures de l'embryon limitent Wnt/Nodal à l'extrémité postérieure de l'embryon pour établir l'axe antéro-postérieur34.

Pour démontrer l'application de la puce Gradient-in-CUBE pour différencier un seul sphéroïde en deux régions localisées, nous avons fourni un milieu de différenciation neuroectoderme (NE) à une extrémité du CUBE et un milieu de différenciation mésoderme (M) sur le côté opposé. Le milieu mésoderme (basé sur un protocole de Lam et al.35) contenait des concentrations élevées d'activateur Wnt CHIR99021, tandis que le milieu neuroectoderme (basé sur un protocole de Bianchi et al.36) contenait un activateur Wnt inférieur avec Nodal/Activin inhibiteur SB431542 pour contrecarrer la différenciation mésoderme du côté neuroectoderme. Après 4 jours de différenciation, des différences morphologiques ont pu être observées aux deux extrémités du sphéroïde, le côté mésoderme ayant une caractéristique plus bosselée et plus saillante, par rapport à la caractéristique plus lisse du côté neuroectoderme. En revanche, les sphéroïdes témoins présentaient des caractéristiques morphologiques plutôt uniformes - le contrôle du mésoderme avait des saillies bosselées sur toute la surface; le contrôle du neuroectoderme avait une surface plus lisse (Fig. 3d).

Il est souvent difficile de visualiser l'expression de la pluripotence cellulaire ou des marqueurs de différenciation dans des échantillons 3D à plus grande échelle comme les organoïdes, en raison de la plage limitée de pénétration du laser, ainsi que de la faible sensibilité des lentilles d'objectif à faible grossissement et des distances focales courtes des lentilles à haute sensibilité. Par conséquent, les organoïdes sont souvent intégrés dans un milieu cryogénique ou de la paraffine et coupés en fines sections pour la coloration et l'imagerie. Cependant, l'orientation de l'échantillon est souvent perdue après avoir récupéré l'échantillon des dispositifs de génération de gradient dominants. Les avantages du dispositif CUBE sont non seulement que les cellules sont contenues dans le CUBE et peuvent être récupérées sans endommager l'échantillon, mais aussi que l'orientation du gradient peut facilement être marquée pour être reconnue plus tard. Ici, nous montrons que les échantillons dans le CUBE peuvent être traités pour la coupe de cryo et de paraffine.

Pour la coupe cryogénique, le cadre plus épais à une extrémité du CUBE où le joint torique était attaché agit comme un marqueur d'orientation. Après avoir récupéré l'échantillon de la puce Gradient-in-CUBE, le CUBE peut simplement être trempé dans du saccharose et du milieu d'enrobage cryo avant de le congeler. Une fois congelé, le CUBE est tranché avec l'échantillon, le cadre CUBE et la paroi extérieure PDMS servant de référence pour préserver l'orientation de l'échantillon (Figs. 2d (i) et 4a). À partir de la coloration par immunofluorescence du sphéroïde hiPSC différencié avec le gradient NE-M, la localisation du marqueur neuroectoderme Sox2 et du marqueur mésoderme Brachyury a été observée aux extrémités opposées respectives du sphéroïde, alors que dans les échantillons témoins, les deux marqueurs étaient exprimés uniformément dans tout le sphéroïde (Fig. 4b). Ainsi, nous avons démontré une méthode pour préserver les informations d'orientation du sphéroïde différencié avec gradient de morphogène en sectionnant l'échantillon tel quel dans le CUBE. Un inconvénient de cette méthode, cependant, est que la lame du microtome est endommagée par la coupe répétée du matériau acrylique dur et peut devoir être remplacée fréquemment. Ce problème peut être résolu en utilisant un matériau plus souple pour le cadre CUBE qui est plus facile à couper, comme le polycarbonate ou le téflon. Alternativement, des microtomes de scie ou des lames revêtues de diamant qui sont couramment utilisées pour sectionner des échantillons durs comme l'os pourraient être utilisés pour couper à travers le cadre CUBE.

a Cryocoupe et imagerie. (i) Étapes pour incorporer et sectionner des échantillons congelés avec CUBE, en utilisant le cadre CUBE comme marqueur de référence pour l'orientation de l'échantillon. (ii) L'immunomarquage du sphéroïde hiPSC différencié avec le gradient M-NE a montré un schéma d'expression localisé des marqueurs mésoderme (Brachyury) et neuroectoderme (Sox2), alors que les contrôles NE uniquement et M uniquement ont montré une distribution uniforme des marqueurs. b Coupe et imagerie en paraffine. (i) Étapes pour incorporer et sectionner les échantillons de paraffine avec le support CUBE pour éviter la perte d'échantillon, puis retirer l'échantillon du CUBE et couper un bord de l'échantillon pour marquer l'orientation. (ii) L'immunomarquage du sphéroïde hiPSC différencié avec le gradient d'endoderme (END)-NE a montré un schéma d'expression localisé des marqueurs d'endoderme (FoxA2) et de neuroectoderme (Nestin), alors que les contrôles NE uniquement et END uniquement ont montré une distribution uniforme des marqueurs.

Pour la section de paraffine, certaines étapes supplémentaires doivent être prises pour préserver l'intégrité et l'orientation du gradient de l'échantillon dans le CUBE (Figs. 2d(ii) et 4b(i) et Fig. 2 supplémentaire). Alors que la section avec le CUBE pourrait être effectuée avec le cryo CUBE qui est composé d'une combinaison de cadre acrylique et de paroi en PDMS qui est un matériau souple, il est beaucoup plus difficile de sectionner le CUBE de paraffine, car l'ensemble du CUBE est en acrylique, ce qui était une modification nécessaire car le PDMS n'est pas compatible avec les solvants organiques utilisés dans le processus d'inclusion de paraffine. Au cours du processus de déshydratation initial avant l'inclusion de paraffine, l'hydrogel perd beaucoup de volume et se rétrécit dans le CUBE. Pour éviter le risque de perdre l'échantillon qui peut se détacher du CUBE, un support CUBE comprenant un couvercle et une base a été conçu pour couvrir la plupart des surfaces ouvertes supérieures et inférieures du CUBE tout en permettant aux réactifs de passer à travers et hors de l'échantillon. Le CUBE dans le support a ensuite été attaché avec un fil pour les maintenir ensemble. Après le processus de paraffinage, l'échantillon a été retiré du CUBE à l'aide d'un gabarit poussoir et l'orientation a été marquée en coupant un bord sur un coin de l'échantillon. Pour démontrer l'application de la méthode de la paraffine, le sphéroïde hiPSC a été différencié avec les médias de différenciation NE et endoderme (END) (basé sur un protocole de Lam et al.35) de chaque côté du CUBE. La coloration par immunofluorescence des marqueurs neuroectodermiques Nestin et Sox2, et des marqueurs endodermiques FoxA2 et Sox17, a montré une localisation respectivement sur les côtés NE et END des sphéroïdes (Fig. 4b (ii) et Fig. 3 supplémentaire). D'autre part, des échantillons témoins sans culture en gradient ont montré une expression uniforme des marqueurs dans tout le sphéroïde.

Les expériences de différenciation FITC/TRITC-dextran et NE/M ainsi que END/NE ont démontré ici que des gradients de morphogène peuvent être générés dans le CUBE et peuvent être utilisés pour contrôler la différenciation des sphéroïdes cellulaires. Il convient de noter, cependant, que le gradient généré par la plate-forme présentée dans cet article repose uniquement sur la libre diffusion des molécules de la source, à travers le gel dans le CUBE, vers le puits. Comme le taux de diffusion libre dépend de la taille, de la charge et de la solubilité du soluté37, ainsi que de la taille des pores, de la charge et de la mobilité du polymère de la matrice d'hydrogel38, des études expérimentales ou de simulation détaillées prenant en compte la molécule génératrice de morphogène spécifique, la diffusivité de chaque molécule et la façon dont les propriétés de l'hydrogel affectent la diffusion de chaque molécule39,40,41,42,43,44,45 peuvent être nécessaires pour comprendre les moindres détails du transport de masse afin d'obtenir un contrôle encore plus fin de la génération de gradient, mais ce niveau de précision dépasse le cadre de cette étude. Alternativement, assurer une concentration constante de facteurs de croissance dans le milieu est un moyen de mieux contrôler la précision du gradient, par exemple avec un changement ou un mélange plus fréquent du milieu, ou en pompant un flux constant de milieu frais vers l'échantillon, bien que ces méthodes augmenteraient la complication des procédures d'installation et de culture.

Le rôle et les mécanismes des gradients de morphogène dans le guidage du destin cellulaire sont complexes et encore mal compris. Lorsque les cellules subissent une auto-organisation pour former des modèles spécifiques du tissu, les gradients locaux générés par les sécrétions des cellules elles-mêmes et de leurs voisins immédiats, ainsi que les gradients externes dans l'ECM entourant les cellules générées par des cellules plus éloignées telles que celles du mésenchyme environnant, contribuent à gouverner la différenciation cellulaire15,16. Des modèles théoriques tels que les modèles de réaction-diffusion, d'information de position (drapeau français) ou de synthèse-diffusion-clairance ont été utilisés pour expliquer ou prédire les interactions à courte et longue portée entre les cellules et le morphogène et la formation de motifs qui en résulte29,45,46, mais ces études se concentrent sur l'environnement local des cellules. D'autre part, la plate-forme de gradient CUBE vise à imiter l'apport de gradients externes par d'autres populations de cellules de la périphérie qui jouent un rôle dans la formation des structures d'ordre supérieur des organes, comme dans les schémas de ramification de la glande mammaire, du rein ou du poumon47,48,49. Par conséquent, une optimisation détaillée de l'interaction entre les cellules et les gradients de divers morphogènes, ainsi que le moment de la formation du gradient serait nécessaire pour développer des organoïdes cibles spécifiques avec le modèle souhaité. En outre, même si les facteurs de croissance ajoutés aux deux extrémités des échantillons de contrôle étaient exactement les mêmes, des gradients des facteurs de croissance existeraient également lorsqu'ils entraient dans le gel par les extrémités opposées, et des études à plus long terme sur la façon dont cela pourrait affecter l'auto-organisation des cellules dans des sphéroïdes plus grands et plus petits seraient nécessaires à l'avenir.

Comme la conception du CUBE et de la puce à gradient peut être personnalisée en fonction des besoins de l'utilisateur, la plate-forme pourrait également être applicable au développement d'organoïdes très complexes, par exemple en appliquant des gradients sur les quatre côtés du CUBE pour générer des organoïdes avec des axes antérieur-postérieur et dorsal-ventral.

L'un des principaux inconvénients de l'utilisation du PDMS pour fabriquer la puce à gradient est l'absorption des protéines et des petites molécules à la surface du PDMS en raison de sa nature hydrophobe50,51,52. Malgré cela, le PDMS présente de nombreux avantages tels que la biocompatibilité, la perméabilité aux gaz, la transparence optique et un processus de fabrication facile. Il existe également plusieurs méthodes relativement simples qui ont été signalées pour réduire l'absorption des protéines, notamment le mélange de PDMS avec du poly (éthylène glycol) (PEG) pour augmenter l'hydrophilie du PDMS53 ou le revêtement de surfaces avec du téflon, du polymère de 2-méthacryloyloxyéthyl phosphorylcholine (MPC) ou de la cire de paraffine54,55,56.

Bien que la coloration par immunofluorescence des marqueurs de différenciation montre une différenciation localisée du sphéroïde, la structure et la morphologie de chaque échantillon sont variées, comme dans le cas du contrôle de l'endoderme sur la figure 4b (ii). Une raison possible de cette variation est que bien que le positionnement du sphéroïde cellulaire soit contrôlé, le sphéroïde initial est formé dans une plaque à 96 puits sans contrôle de la forme du sphéroïde. Avec plusieurs études rapportant la contribution des contraintes géométriques pour imiter la structuration et les événements de rupture de symétrie du développement dans la culture in vitro57,58, il peut être préférable d'appliquer la méthode du capuchon moulé pour positionner des cellules individuelles dans un hydrogel 3D avant la formation de sphéroïdes à l'avenir pour contrôler la forme d'ensemencement initiale, par exemple en imprimant en 3D la forme géométrique souhaitée avec du verre glucidique et en dissolvant le glucide après que le gel a durci pour laisser derrière lui une poche d'ensemencement avec la forme souhaitée correspondante59.

Un avantage de la modularité de la conception du CUBE et de la puce est que le choix du matériau peut être sélectionné en fonction des besoins des expériences. Par exemple, si la transparence optique est prioritaire, un CUBE avec une fenêtre PDMS est plus adapté ; considérant que si la paraffine de l'échantillon pour l'analyse post-expérience est nécessaire, un CUBE entièrement en acrylique sans PDMS est plus approprié, même si la clarté optique est légèrement réduite, en raison de l'incompatibilité du PDMS avec les solvants organiques. En conséquence, le choix du matériau pour la puce à gradient ne doit pas nécessairement être le même que celui du CUBE et doit être choisi en tenant compte des avantages et des inconvénients du matériau60,61.

La culture d'organoïdes 3D avec gradient de morphogène a longtemps été un défi à la fois en termes de configuration de dispositif de gradient compliqué et de maintien de l'orientation du gradient pendant les processus d'analyse. Dans cet article, nous présentons un flux de travail de culture à imagerie gradient qui utilise le dispositif de culture modulaire CUBE pour configurer facilement un dispositif Gradient-in-CUBE. Comparé aux gradients générés dans les puces microfluidiques standard qui peuvent être contrôlées dynamiquement à l'aide du débit et de la pression, le gradient généré à l'aide de notre dispositif à gradient simple est moins contrôlable dans le temps car il repose uniquement sur la libre diffusion des molécules. Cependant, la plate-forme présentée ici se concentre sur la convivialité pour les biologistes et ne nécessite aucune configuration compliquée impliquant des pompes ou des seringues. De plus, tout comme l'itération précédente du CUBE a été commercialisée, la commercialisation du CUBE avec diverses modifications pour répondre aux besoins des utilisateurs augmenterait encore la convivialité et l'adoption de la plate-forme CUBE par les laboratoires moins enclins à l'ingénierie. De plus, après l'expérience, l'échantillon peut être facilement retiré de l'appareil sans endommager l'échantillon tout en conservant des informations sur la direction dans laquelle le gradient s'est formé. Bien qu'une optimisation supplémentaire dépendante des organoïdes cibles des protocoles de culture puisse être nécessaire pour déterminer les pentes de gradient les plus appropriées pour des facteurs de croissance spécifiques dans le matériau ECM de support choisi, les méthodologies simples et personnalisables de cet article ont le potentiel de faire progresser de manière significative le développement des organoïdes via la rupture de symétrie.

Un point intéressant à considérer dans les travaux futurs, cependant, est la contribution potentielle des différences de stimulation mécanique que les cellules subissent en fonction de la taille des sphéroïdes par rapport à la taille de la poche d'ensemencement créée par le capuchon de moule, car le scellement de la poche avec hydrogel supplémentaire peut introduire une certaine variation de la rigidité du gel en raison de l'excès de support dans la poche lorsque les sphéroïdes y sont ensemencés. La plate-forme Gradient-in-Cube dans sa forme actuelle ne génère un gradient que dans une direction, mais elle a également le potentiel d'être adaptée pour générer des gradients dans deux axes, par exemple, les axes antérieur-postérieur et dorsal-ventral dans le même organoïde, ce qui est un travail en cours. Par conséquent, le flux de travail de la génération d'organoïdes avec différenciation localisée à l'analyse avec des informations de gradient pourrait fournir aux chercheurs une méthode conviviale pour développer des organoïdes de plus en plus complexes afin d'élargir notre compréhension de divers mécanismes tels que la rupture de symétrie qui sont impliqués dans les processus de développement.

Des iPSC humaines (IMR90-4 ; WiCell Research Institute ; WB65317) ont été maintenues avec mTeSR Plus (STEMCELL Technologies, 100-0276) sur des boîtes recouvertes de Matrigel à facteur de croissance réduit de 9 à 10 μg/cm2 (Corning, 356231), passées régulièrement à l'aide de ReLeSR (STEMCELL Technologies, 05872) et cultivées à 37 °C, Incubateur 5% CO2. Les cellules ont été testées pour la contamination par les mycoplasmes à l'aide du kit MycoAlert (Lonza, LT07-118). Pour préparer des plaques à 96 puits pour la formation de sphéroïdes, les puits ont été remplis avec 80 μL/puits d'agarose à 3 % (Sigma, A9414) et laissés se solidifier. Le milieu StemFit AK02N (Ajinomoto, RC AK02N) plus 10 μM d'inhibiteur de Rock (Y-27632; Nacalai Tesque, 08945-84) a ensuite été ajouté au puits et incubé. Pour la formation de sphéroïdes, 70 % de cellules confluentes ont été dissociées à l'aide de ReLeSR et remises en suspension dans du milieu StemFit + Y27632 après centrifugation, avant l'ensemencement dans une plaque à puits d'agarose. Les cellules d'un plat de 35 mm ont été utilisées pour fabriquer 5 sphéroïdes (environ 2 à 3 × 104 cellules par sphéroïde). Le lendemain, le milieu a été remplacé par le milieu mTeSR Plus sans Y27632. Les sphéroïdes ont été transférés sur le dispositif CUBE après une journée de culture dans mTeSR Plus.

Le choix des matériaux pour le CUBE a dû être soigneusement étudié pour répondre aux exigences de chaque procédure, d'autant plus que le processus de paraffine implique l'utilisation de réactifs organiques. Le cadre CUBE est passé du polycarbonate précédemment utilisé à un matériau acrylique, qui est plus résistant au traitement au xylène pendant de courtes périodes par rapport au polycarbonate. De plus, le polydiméthylsiloxane (PDMS), un matériau biocompatible à base de silicone transparent a été utilisé comme matériau de paroi latérale pour limiter le mouvement des supports contenant du morphogène à travers le CUBE aux seuls côtés supérieur et inférieur du CUBE, générant ainsi un gradient dans un seul axe du CUBE.

Deux types de CUBE en acrylique (poly (méthacrylate de méthyle); PMMA) ont été conçus pour cette étude à l'aide du logiciel Rhinoceros 3D (Robert McNeel & Associates). Pour la cryosection, les CUBE ont été conçus avec un cadre plus épais sur la face supérieure du cube afin qu'un joint torique en nitrile (AS ONE, 62-3049-63) puisse être fixé au cube (Fig. 2a (i)) pour une étanchéité étanche afin de réduire les fuites de support autour du cube pendant la culture en gradient. Pour fabriquer les parois latérales du Cryo CUBE, du PDMS (Silpot 184, Dow Toray, 04133124) a d'abord été préparé en mélangeant une base élastomère avec un réactif de durcissement dans un rapport de 10:1. Ensuite, une fine couche du mélange a été étalée dans une boîte de Pétri et dégazée pour éliminer les bulles d'air. Les cadres de cube ont été placés sur le PDMS, puis dégazés à nouveau et cuits à 85°C pendant 30 min pour durcir le PDMS. Une fois durci, le PDMS a été coupé des cadres avec un scalpel, et le processus a été répété pour couvrir les trois autres côtés du cube, laissant les surfaces supérieure et inférieure ouvertes (Fig. 2a (ii)). L'épaisseur de la paroi PDMS est équivalente à l'épaisseur du cadre CUBE qui est de 0,75 mm lorsque ~ 2,8 g de PDMS par plat de 100 mm ont été utilisés. Étant donné que le PDMS gonfle lorsqu'il est exposé au xylène, les CUBE pour la section de paraffine ont été conçus sans parois latérales (Fig. 2a (i)). Bien que cela réduise légèrement la clarté des échantillons, un cadre entièrement en acrylique offrait toujours une visibilité suffisante en fond clair. Pour la coupe en paraffine, les CUBE ont été conçus comme un cube solide de 5 mm de long avec un noyau creux de 3, 5 × 3, 5 mm, l'épaisseur du cadre étant de 0, 75 mm (Fig. 2a (i)). Les CUBE pour la coupe en paraffine n'avaient pas de parois latérales en PDMS car le PDMS gonfle dans le xylène pendant le processus de paraffine. Tous les CUBE ont été commandés auprès d'entreprises d'usinage (Cryo CUBE de Yumoto Electric Inc, Japon, et Paraffin CUBE de Proto Labs, Japon). Avant utilisation, les CUBE ont été lavés deux fois aux ultrasons, une fois avec de l'eau MilliQ et une fois avec de l'isopropanol (IPA), puis séchés au four pendant 2 h.

Pour contrôler le positionnement des cellules lors de l'ensemencement initial dans le CUBE, un capuchon de moule a été conçu avec une structure de pilier à la position d'ensemencement souhaitée et avec des rainures pour garantir que le moule s'adapte sur le dessus du cube afin que la position du pilier puisse être correctement alignée dans le cube (Fig. 2b(i)). Les capuchons de moule ont été imprimés à l'aide d'une imprimante 3D (Agilista 3200, Keyence), et nettoyés par ultrasons deux fois avec de l'IPA après avoir retiré l'excès de matériau de support d'impression, puis séchés dans un four à 65°C. Avant utilisation, le capuchon du moule a été plongé dans de la 2-méthacrylooyloxtéthyl phosphorylcholine (MPC; Lipidure, NOF Corporation, CM5206E) diluée à 5% dans de l'isopropanol, puis laissée sécher pendant 1 h à température ambiante (TA). Le revêtement MPC aide à assurer un détachement plus doux du moule de l'hydrogel. Un joint torique en nitrile a été fixé à la partie épaisse du cadre en acrylique pour le Cryo CUBE, soit à environ 1 mm près d'une extrémité du Paraffin CUBE. Les CUBE ont été placés côté joint torique vers le bas dans une boîte et du Matrigel a été ajouté dans le CUBE avant de placer le capuchon du moule sur le dessus du CUBE et de durcir le gel dans l'incubateur pendant 25 minutes. Une fois le gel durci, le capuchon du moule a été retiré et des sphéroïdes hiPSC ont été ensemencés dans la poche créée par le moule. Ensuite, du Matrigel supplémentaire a été ajouté au sommet du CUBE et laissé durcir pendant 25 minutes supplémentaires pour sceller la poche (Fig. 2b (ii)). Après durcissement, le CUBE a été transféré dans une plaque à 48 puits avec du milieu mTeSR Plus et incubé pendant 2 h avant de commencer la culture en gradient.

Les moules pour la fabrication du couvercle des puces à gradient PDMS ont été conçus avec des rainures pour s'adapter au joint torique et aux orifices pour l'ajout de support, tandis que la base a été conçue pour s'adapter au cube, au joint torique et à deux chambres de support séparées (Fig. 2c (i)). Les moules PDMS ont été commandés auprès de Proto Labs. Pour fabriquer les puces PDMS, du PDMS non durci a été versé dans les moules, puis dégazé et cuit à 85 ° C pendant 1 h pour durcir le PDMS. Une fois durcies, les puces ont été retirées des moules, puis lavées et stérilisées de la même manière que les CUBE. Pour assembler la puce à gradient, des CUBE ont été placés dans la base de la puce avec le joint torique inséré dans la rainure du joint torique, et un film adhésif double face PDMS (NSD-100, NIPPA) avec des trous pour accéder aux chambres de médias découpées a été utilisé pour sceller le couvercle et la base ensemble (Fig. 2c (ii)). Après assemblage, les chambres de médias de chaque côté du CUBE ont été remplies avec les médias de différenciation respectifs (Fig. 2c (iii)).

Le milieu de différenciation Neuroectoderm comprenait un mélange 1:1 de KnockOut DMEM/F12 (Gibco, 12660-012) et de milieu Neurobasal (Gibco, 21103-049) additionné de 10 % de remplacement de sérum KnockOut (Gibco, 10828010), 1 % d'acides aminés non essentiels MEM (Nacalai Tesque, 06344-56), 1 % GlutaMAX (Gibco, 35050-061), 1 μM LDN1913189 (Sigma, SML0559), 2 μM SB431542 (Nacalai Tesque, 18176-54), 3 μM CHIR99021 (Nacalai Tesque, 18764-44), 0,1 mM 2-mercaptoéthanol ( Nacalai Tesque, 21438-82) et acide ascorbique 0,5 μM (Nacalai Tesque, 03420-52). Le milieu de base Mesendoderm comprenait du milieu RPMI 1640 (Gibco, 11875-093), 1 % de GlutaMAX et 1 % de pénicilline-streptomycine (Gibco, 15140122). Pour la différenciation du mésoderme, 5 μM de CHIR99021 ont été ajoutés au milieu de base du mésendoderme aux jours 0 et 1. Des jours 2 à 4, CHIR99021 a été retiré et remplacé par 100 ng/mL de bFGF (Nacalai Tesque, 19155-36) et 1 μM d'acide rétinoïque tout-trans (Stemgent, 04-0021). Pour la différenciation de l'endoderme, 5 μM de CHIR99021 ont été ajoutés au milieu de base du mésendoderme au jour 0, et des jours 2 à 5, CHIR99021 a été retiré et remplacé par 100 ng/mL d'activine A (R&D Systems, 338-AC-050/CF). Le changement de support a été effectué tous les jours en jetant les supports usés, en les lavant une fois avec du DPBS et en les remplaçant par des supports frais. Des images de contraste de phase des sphéroïdes dans le CUBE dans le dispositif à puce ont été prises à l'aide du microscope Olympus CKX41 pour surveiller les changements morphologiques du sphéroïde.

Au moment approprié pour l'analyse, les échantillons ont été retirés de la puce à gradient et transférés dans une plaque à 48 puits pour fixation. Les échantillons ont été lavés deux fois avec du DPBS pendant 5 min à chaque fois, fixés avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 min, puis lavés deux fois avec du DPBS pendant 10 min à chaque fois. Pour la cryosection, les échantillons ont été trempés dans 10 %, 15 % et 20 % de saccharose (Wako, 194-00011) successivement pendant 1 h chacun, et dans un milieu d'inclusion de cryosection (composé Tissue-Tek OCT ; Sakura Finetek, 4583) pendant 10 min avant d'être incorporés dans un milieu d'inclusion et congelés à -80 °C pendant 30 min. Après congélation, les échantillons ont été retirés du moule et sectionnés à 30 μm d'épaisseur tels quels avec le CUBE (Fig. 2d (i)) à l'aide d'un microtome (Yamato Kohki Industrial, Retoratome REM-710) équipé d'une unité de congélation (Yamato Kohki Industrial, Electro Freeze MC-802A). Les sections recueillies sur des lames de verre ont été séchées à l'air frais pendant 30 min, puis dans un four à 40 ° C pendant 30 min supplémentaires, puis lavées dans de l'eau MilliQ pour éliminer l'excès de milieu d'enrobage. L'excès d'eau a été éliminé et les sections séchées à TA pendant 10 min.

Pour la coupe en paraffine, les échantillons ont été déshydratés et inclus dans de la paraffine selon la procédure suivante : 70 % d'éthanol pendant 2 h, 70 % d'éthanol pendant une nuit, 80 % d'éthanol pendant 1 h, 95 % d'éthanol pendant 1 h, 99 % d'éthanol pendant 1 h, 100 % d'isopropanol pendant 1 h deux fois, 100 % de xylène pendant 1 h trois fois, mélange 1: 1 de xylène et de paraffine (Nacalai Tesque, 26029-05) pendant une nuit à 40 °C et de la paraffine pendant 1,5 h trois fois à 65 °C. Pour éviter la perte d'échantillon due au rétrécissement du Matrigel pendant le processus de déshydratation, un support CUBE avec couvercle et base maintenus ensemble par un fil a été conçu pour contenir l'échantillon dans le CUBE (Fig. 2d (ii)). Après la dernière étape de paraffine, l'échantillon a été retiré du support CUBE et inclus dans de la paraffine fraîche. Le CUBE a été découpé de la paraffine et l'échantillon a été retiré du CUBE en coupant la paraffine le long du cadre intérieur du CUBE à l'aide d'un scalpel et en appuyant sur le CUBE sur un gabarit poussoir (Fig. 2d (ii)). Un bord de l'échantillon paraffiné a été coupé pour marquer l'orientation de la direction du gradient, et l'échantillon a été sectionné en tranches de 10 μm d'épaisseur à l'aide d'un microtome. Le déparaffinage a été effectué comme suit : xylène 100 % pendant 10 min deux fois, éthanol à 99 % pendant 5 min deux fois, éthanol à 95 % pendant 5 min, éthanol à 80 % pendant 5 min, éthanol à 70 % pendant 5 min, eau MilliQ pendant 5 min. La récupération d'antigène induite par la chaleur a été réalisée en plaçant les échantillons dans un tampon citrate 10 mM (acide citrique 1,8 mM, citrate trisodique 8,2 mM, pH 6) et en chauffant le tampon jusqu'à ébullition, puis en le refroidissant pendant 1 min. Le processus d'ébullition et de refroidissement a été répété 6 fois avec 10 secondes d'ébullition suivies de 1 minute de refroidissement. Après le dernier cycle, les échantillons ont été refroidis pendant 30 min, puis lavés avec de l'eau MilliQ pendant 5 min, suivis de DPBS pendant 5 min trois fois.

Les échantillons cryo-sectionnés ont été perméabilisés avec 0, 5% de Triton X-100 pendant 10 min, suivis de trois lavages avec 100 mM de glycine pendant 10 min à chaque fois. Le tampon d'immunofluorescence (tampon IF) était composé de 0, 5% de Tween20, 2% de Triton X-100 et 10% d'albumine de sérum bovin (BSA; Sigma, 126615) dans du DPBS. Le blocage a été effectué en incubant des échantillons avec du tampon IF avec 10 % de sérum de chèvre (Gibco, 16210064) (IF + G) pendant 30 min, puis IF + G avec 1 % d'IgG anti-souris de chèvre (Bethyl Laboratories, A90-116A) pendant 20 min. Les anticorps ont été dilués (1:200 ou 1 μg/mL) selon le tableau supplémentaire 1. Les anticorps primaires ont été incubés pendant 90 min et les anticorps secondaires (Alexa fluor, 1:200, Thermo Fisher Scientific)) incubés pendant 50 min. Après chaque incubation d'anticorps, les échantillons ont été lavés trois fois avec du tampon IF pendant 15 minutes. Les noyaux ont été colorés avec du DAPI pendant 20 min, puis lavés avec du DPBS pendant 5 min trois fois.

Pour suivre la formation du gradient sur une période de temps, CUBE rempli d'agarose à 1,5% a été placé dans la puce à gradient avec 10 μM 40 kDa fluorescéine isothiocyanate (FITC)-dextrane (Sigma, FD40S) dans DPBS à une extrémité du CUBE, et 10 μM 40 kDa tétraméthyl rhodamine B isothiocyanate (TRITC)-dextrane (Td B Labs, TD40) dans DPBS à l'autre extrémité. Toutes les 24 h, le FITC-dextran et le TRITC-dextran ont été jetés et les chambres de milieu lavées une fois avec du DPBS avant de les remplacer par du dextrane frais. Suite à ces étapes, l'imagerie à la fenêtre du CUBE (w = 2,75 mm ; h = 3,5 mm) a été réalisée à l'aide d'un microscope à fluorescence (BZX-700, Keyence) à un grossissement ×4 (champ de vision : w = 3,6 mm ; h = 2,7 mm). La zone de fenêtre du CUBE était à 1,5 mm de la source du côté FITC et à 0,75 mm de la source du côté TRITC en x ; 0,75 mm du mur CUBE en y ; et 2,5 mm du bas du CUBE en z. Les intensités FITC et TRITC ont été mesurées à partir d'images de fluorescence à l'aide de l'outil Plot Profile du logiciel ImageJ sur une zone au centre de l'image (w = 2,2 mm; h = 2,2 mm), ce qui donne l'intensité moyenne le long de l'axe vertical y pour chaque pixel sur l'axe x. La concentration (C) a ensuite été calculée par corrélation linéaire avec une courbe standard des intensités FITC et TRITC-dextran de diverses concentrations (données supplémentaires 1). Le gradient a été calculé comme le rapport de la concentration à 0,2 mm et à 2,0 mm (Cx0,2/Cx2,0 pour FITC et Cx2,0/Cx0,2 pour TRITC) pour exclure les régions aux deux extrémités de la fenêtre CUBE car la proximité du cadre CUBE a affecté l'intensité du dextran et pour représenter la région approximative du sphéroïde.

Toutes les tailles d'échantillon sont supérieures à cinq et spécifiées dans les légendes des figures. La valeur p a été calculée par le test de Kolmogorov – Smirnov (KS) dans Matlab.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Les données sources sous-jacentes à la Fig. 3c et à la Fig. 1c supplémentaire sont fournies dans les Données supplémentaires 1.

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Cette recherche a été soutenue par des fonds des numéros de subvention JSPS KAKENHI 21H01299 et 21K18048. Certaines illustrations ont été générées à l'aide de Biorender.

Cluster for Pioneering Research, RIKEN, Saitama, 351-0198, Japon

Elizabeth Koh et le roi Hagiwara

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IK et MH ont conçu l'étude, conçu et mené des expériences et analysé les résultats. IK a écrit le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit soumis.

Correspondance avec Masaya Hagiwara.

Les auteurs détiennent les brevets suivants : (i) Relatif au dispositif CUBE - Approuvé : 6877009 (Japon), US 11 155 775 B2 (USA) ; En attente : 201680069487.6 (Chine) ; Candidat : Université métropolitaine d'Osaka et Institut de technologie de Kyushu ; Inventeurs : Masaya Hagiwara et Tomohiro Kawahara, (ii) Relatif au dispositif CUBE et au dispositif fluidique - Approuvé : 7055386 (Japon) ; En attente : 16/484 506 (États-Unis), 16/484 506 (EP) ; Candidat : Université métropolitaine d'Osaka ; Inventeur : Masaya Hagiwara, (iii) Relatif à la section du dispositif CUBE - En attente : 2022-140997 (Japon) ; Demandeur : RIKEN ; Inventeurs : Masaya Hagiwara, Isabel Koh. Le brevet 6877009 est concédé sous licence à Nippon Medical & Chemical Instruments Co., Ltd.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef principaux : Marco Fritzsche, Manuel Breuer.

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Réimpressions et autorisations

Koh, I., Hagiwara, M. Gradient to sectioning CUBE workflow pour la génération et l'imagerie d'organoïdes avec différenciation localisée. Commun Biol 6, 299 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04694-5

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Reçu : 27 septembre 2022

Accepté : 10 mars 2023

Publié: 21 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04694-5

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