Modulation de la myosine par la protéine de liaison à la myosine cardiaque - Visionnaire de ShenyangPeak Ventures Co., Ltd

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 4337 (2022) Citer cet article

2305 accès

1 Citations

Détails des métriques

La protéine C de liaison à la myosine cardiaque (cMyBP-C) est un régulateur important de la fonction sarcomère. La phosphorylation réduite de cMyBP-C a été liée à une contractilité compromise chez les patients souffrant d'insuffisance cardiaque. Ici, nous avons utilisé les peptides cMyBP-C 302A et 302S publiés précédemment, des substituts de la sérine 302 du site de phosphorylation régulateur, comme outil pour déterminer les effets de la modulation de l'état de déphosphorylation de cMyBP-C sur la contraction et la relaxation cardiaques dans l'insuffisance cardiaque expérimentale (HF ) modèles in vitro. Les deux peptides ont augmenté la contractilité des fibres musculaires papillaires isolées à partir d'un modèle de souris exprimant la phospho-ablation cMyBP-C (cMyBP-CAAA) de manière constitutive. Le peptide 302A, en particulier, pourrait également améliorer le taux de redéveloppement de la force (ktr) dans les fibres musculaires papillaires des souris cMyBP-CAAA (alanines non phosphorylées). Conformément aux résultats ci-dessus, les deux peptides ont augmenté les taux d'ATPase dans les myofibrilles isolées de rats atteints d'infarctus du myocarde (IM), mais pas de rats fictifs. De plus, dans le modèle de souris cMyBP-CAAA, les deux peptides ont amélioré les taux d'hydrolyse de l'ATPase. Ces changements n'ont pas été observés chez les souris ou les rats fictifs non transgéniques (NTG), indiquant les effets spécifiques de ces peptides dans la régulation de l'état de déphosphorylation de cMyBP-C dans les conditions pathologiques de HF. Prises ensemble, ces études démontrent que la modulation de l'état de déphosphorylation de cMyBP-C peut être une approche thérapeutique pour améliorer la fonction de la myosine, la contractilité du sarcomère et la relaxation après un événement cardiaque indésirable. Par conséquent, le ciblage de cMyBP-C pourrait potentiellement améliorer les performances cardiaques globales en complément des médicaments de soins standard chez les patients atteints d'IC.

La protéine C de liaison à la myosine cardiaque (cMyBP-C) est une protéine de filament épais sarcomère de 140 kDa qui se localise à intervalles réguliers dans la zone C du sarcomère pour réguler la structure et la fonction du sarcomère dans le cœur1,2. La régulation de cMyBP-C découle de trois sites de phosphorylation au niveau du domaine M et de l'interaction de sa région N-terminale avec la myosine et l'actine3,4. Alors que la cMyBP-C est fortement phosphorylée dans des conditions physiologiques normales, ses niveaux de phosphorylation chutent dans les états pathologiques5. Cela peut être observé à la fois dans les modèles précliniques d'insuffisance cardiaque (IC) et, cliniquement, chez les patients atteints de cardiomyopathie hypertrophique (HCM), d'IC ou de fibrillation auriculaire6. Malgré les avantages évidents du ciblage de la cMyBP-C, aucun médicament n'est actuellement disponible pour modifier directement la cMyBP-C déphosphorylée afin d'améliorer la fonction cardiaque.

Les protéines cMyBP-C humaines et murines ont trois sites majeurs de phosphorylation, plus de 17 sites au total7,8. Ceux-ci sont situés dans le domaine M à l'extrémité N-terminale de la molécule, et tous sont absents de l'isoforme du muscle squelettique9. La région de l'extrémité N-terminale se lie au segment S2 de la myosine, à proximité du domaine du bras de levier10,11. Cette interaction peut être régulée dynamiquement par phosphorylation/déphosphorylation de cMyBP-C. Dans des conditions physiologiques, la cMyBP-C phosphorylée facilite l'activation du cycle des ponts croisés, en attachant les filaments sarcomères épais et fins12. Cependant, lorsque cMyBP-C se déphosphoryle dans des conditions pathologiques, il interagit fortement avec la myosine, empêchant ainsi son interaction génératrice de force avec l'actine13,14,15. De même, le clivage catalytique de la région N-terminale de cMyBP-C pendant l'infarctus du myocarde réduit le nombre de sites de phosphorylation, entraînant une diminution de la contractilité et de la fonction cardiaques16.

Des études antérieures ont déterminé la nécessité et la suffisance de la phosphorylation de cMyBP-C pour réguler la fonction cardiaque normale17,18,19,20. Ces études ont utilisé des souris transgéniques cardiaques spécifiques (TG) exprimant une cMyBP-C phospho-ablée au niveau des sites Ser-273-Ala/Ser-282-Ala/Ser-302-Ala (AAA) ou une cMyBP-C phospho-mimétique au niveau de Ser- 273-Asp/Ser-282-Asp/Ser-302-Asp (DDD) par rapport aux souris témoins non transgéniques (NTG). Par conséquent, pour cibler thérapeutiquement cMyBP-C afin d'améliorer la fonction cardiaque après un événement cardiaque indésirable, nous avons utilisé des modèles précliniques, comme indiqué dans la littérature. Dans le premier modèle, les trois sites de phosphorylation de la sérine (273, 282 et 302) ont été mutés en alanines non phosphorylables (AAA)18. Dans un autre modèle, ils ont été mutés en acides aspartiques phospho-mimétiques (DDD)19 pour imiter l'état physiologique du cœur. Le remplacement de l'AAA a entraîné une fonction cardiaque déprimée, de sorte que la protéine n'a pas pu sauver le phénotype nul cMyBP-C18, tandis que la substitution DDD a pu sauver le phénotype nul cMyBP-C19. La souris transgénique exprimée cMyBP-C de type sauvage a servi de contrôle NTG.

Ici, nous avons testé les peptides conçus sur la base du domaine M de cMyBP-C21. Nous avons émis l'hypothèse que les peptides interrompraient probablement l'interaction de cMyBP-C et de la myosine, améliorant ainsi l'interaction de la tête de myosine avec le filament fin et, par conséquent, la course motrice. Les peptides cMyBP-C testés pourraient perturber l'interaction étroite entre cMyBP-C et la myosine, libérant les filaments épais pour reprendre leur interaction avec les filaments fins afin d'améliorer la contractilité musculaire. En effet, en perméabilisant 302A, substitut du site de phosphorylation en 302, le peptide a empêché la myosine d'interagir avec cMyBP-C, entraînant son mouvement vers l'actine, qui à son tour a entraîné la formation d'interactions et de ponts croisés avec l'actomyosine, améliorant ainsi la contractilité. Dans l'ensemble, l'évaluation du peptide 302A in vitro a conduit à la découverte d'une amélioration de la génération de force et de la sensibilité au calcium dans les fibres musculaires cardiaques. Cependant, le ou les mécanismes sous-jacents à l'amélioration de la cinétique contractile par rapport à l'état de phosphorylation de cMyBP-C n'ont pas été entièrement élucidés. Dans des conditions pathologiques, nous avons émis l'hypothèse, comme suggéré ci-dessus, que le peptide 302A modifie les propriétés de liaison de cMyBP-C dans son état déphosphorylé pour améliorer la cinétique cardiaque. Pour tester cette hypothèse, les effets des peptides cMyBP-C 302A et 302S ont été évalués dans trois tests in vitro différents : un test d'ATPase à l'état d'équilibre, un test d'ATPase de myofibrille et un test de muscle papillaire. Les données générées à partir d'essais in vitro et de modèles HF précliniques fournissent des preuves solides que la modulation de cMyBP-C et, par conséquent, son statut de phosphorylation, augmente l'activité ATPase et la cinétique de force d'une manière qui améliore les performances cardiaques globales.

Pour tester l'effet de l'état de phosphorylation de cMyBP-C sur le modèle de rat MI-HF, nous avons recueilli des échantillons de protéines de la zone d'infarctus ventriculaire gauche (LV) des rats MI et une zone comparable d'animaux fictifs à cinq moments différents après la chirurgie MI : jour 1, jour 3, semaine 1, semaine 4 et semaine 8. Les paramètres fonctionnels cardiaques globaux ont été mesurés à quatre moments (jour 3, semaine 1, semaine 4 et semaine 8) après une intervention chirurgicale pour confirmer le développement d'une insuffisance cardiaque (Fig. S1 supplémentaire). La phosphorylation de cMyBP-C a été détectée à l'aide d'anticorps ciblant spécifiquement les sites de phosphorylation de la sérine aux positions 273, 282 et 302, ainsi que d'anticorps pour détecter les niveaux d'expression totaux de cMyBP-C (Fig. 1, Fig. Supplémentaires S2–7). L'alpha-actine a été utilisée comme protéine d'entretien ménager pour la normalisation aux jours 1 et 3. L'HPRT a été utilisée comme protéine d'entretien ménager pour la normalisation aux semaines 1, 4 et 8 après l'IM, en raison de la réduction significative de l'alpha-actine niveaux à la semaine 1 après l'IM (Fig. S8 supplémentaire). Les résultats suggèrent que les niveaux d'expression de la cMyBP-C totale, ainsi que les trois résidus de sérine phosphorylés (p273, p282 et p302), ont été réduits de manière significative aux premiers moments (jour 1 et jour 3), suivis d'une tendance à la réduction à Échantillons post-IM de la semaine 1 (Fig. 1, Fig. supplémentaires S2 à S5). Étonnamment, l'expression des trois sites de phosphorylation a augmenté à des moments ultérieurs (échantillons post-IM des semaines 4 et 8; Fig. S2 supplémentaire), à l'exception de p273 à la semaine 8, peut-être le résultat d'un effet compensatoire au fur et à mesure que l'IC progressait. Nous avons remarqué que l'expression de la cMyBP-C totale suivait de près la tendance des changements de phosphorylation de la cMyBP-C (Fig. 1, Fig. S2 supplémentaire), indiquant que le principal effet de la lésion cardiaque était sur l'expression totale de la cMyBP-C. Par conséquent, nous avons calculé le rapport entre les phosphosites cMyBP-C (p273, p282 et p302) et l'expression totale de cMyBP-C (Fig. S8 supplémentaire). La phosphorylation des sites cMyBP-C (p273 et p282) en cMyBP-C totale était inchangée au jour 1 après l'IM, mais a augmenté de manière significative sur les trois phosphosites (p273, p282 et p302) au jour 3, semaine 1, semaine 4 et la semaine 8 post-infarctus du myocarde par rapport à la simulation. De plus, nous avons également testé l'expression de la troponine T et de la troponine I, qui ont également montré une réduction constante à tous les moments (Fig. S9 supplémentaire). Fait intéressant, l'expression réduite de la chaîne lourde de la myosine (CMH) a été retardée et n'a été observée qu'au jour 3 après l'IM. Une compensation rapide de l'expression du CMH s'est produite avec une augmentation spectaculaire à des moments ultérieurs (semaine 4 et semaine 8 après l'IM ; Fig. S9 supplémentaire).

La phosphorylation de cMyBP-C a été réduite au jour 1 et au jour 3, mais pas à la semaine 1 chez les rats post-IM par rapport au simulacre. (A) Western blot (Wes) de cMyBP-C phosphorylée testée avec des anticorps phospho cMyBP-C spécifiques au site p273, p282, p302, des anticorps cMyBP-C totaux et des anticorps de protéine domestique alpha-actine ou HPRT. Des homogénats entiers de tissu d'infarctus du ventricule gauche de rats MI et de la même zone de rats fictifs ont été utilisés pour Wes. Chaque voie représente un capillaire individuel chargé avec la même quantité de protéines. Les images Wes originales pleine longueur sont présentées dans les figures supplémentaires. S3–S5. (B) Quantification de cMyBP-C p273, p282 et p302 normalisés aux protéines domestiques. Les données représentent les moyennes ± SEM (N = 6–8). **p < 0,01 ; ***p < 0,005 ; ****p < 0,001 ; test t de Student bilatéral non apparié.

Pour tester le statut de phosphorylation de cMyBP-C dans l'IC humaine, une immunohistochimie (IHC) a été réalisée à l'aide de coupes de tissus cardiaques de donneurs sains normaux, ainsi que de patients atteints de cardiomyopathie hypertrophique (HCM) et de cardiomyopathie dilatée (DCM) (N = 4 patients par groupe , figure 2A). Les échantillons de HCM et de DCM ont été confirmés par un physiologiste qualifié. L'IHC a été réalisée en utilisant des anticorps contre p273 et p282, ainsi qu'un anticorps contre la cMyBP-C totale. L'expression relative de p273 était légèrement réduite dans les tissus cardiaques de HCM, mais pas chez les patients DCM (Normal 0, 72 ± 0, 08 vs HCM 0, 48 ± 0, 06, p = 0, 06; DCM 0, 78 ± 0, 10; n = 16; Fig. 2B). D'autre part, l'expression relative de p282 a été réduite de manière significative chez les patients HCM et DCM (Normal 1,64 ± 0,16 vs HCM 0,93 ± 0,06, p < 0,005 ; Normal 1,64 ± 0,16 vs DCM 1,04 ± 0,11, p < 0,01). Par conséquent, les données IHC de patients humains ont fortement soutenu la réduction de la phosphorylation de cMyBP-C dans l'IC humaine.

L'immunohistochimie de coupes de tissus cardiaques de patients HCM et DCM a montré une réduction de la phosphorylation de cMyBP-C par rapport aux donneurs sains. (A) Images IHC de p273 et p282 dans des échantillons cardiaques normaux, HCM et DCM. (B) Quantification correspondante de p273 et p282 dans tous les échantillons cardiaques. Les valeurs de p273 et p282 ont été normalisées aux valeurs totales de cMyBP-C. Les données représentent la moyenne ± SEM (N = 4 patients, n = 16 images). La barre d'échelle en chiffres représente 20 µm. DCM, cardiomyopathie dilatée ; HCM, cardiomyopathie hypertrophique : IHC, immunohistochimie. **p < 0,01 ; ***p < 0,005 ; ANOVA unidirectionnelle avec post-test de Tukey.

Les effets des peptides cMyBP-C 302A et 302S (tableau 1) dans la modulation de cMyBP-C ont été testés dans trois tests in vitro différents. Le dosage de l'ATPase à l'état d'équilibre impliquait la myosine, l'actine et la cMyBP-C pleine longueur (FL), ou une protéine recombinante C0-C2 tronquée (non phosphorylée [−P] ou phosphorylée [+P]). L'activité ATPase a été mesurée en détectant le Pi libéré de l'hydrolyse de l'ATP. L'inhibition de l'activité de la myosine ATPase a été observée avec des concentrations croissantes de protéines C0-C2 et FL cMyBP-C (Fig. 3A, C). C0-C2 était beaucoup plus puissant pour inhiber l'activité ATPase par rapport à la protéine FL cMyBP-C (3,16 ± 0,18 contre 6,66 ± 0,11 µM). Bien que la protéine phosphorylée, C0-C2 ou FL, ait déplacé la courbe d'inhibition vers la droite, ni le peptide 302A ni le peptide 302S n'ont amélioré l'activité de la myosine ATPase testée à diverses concentrations (Fig. 3B, D). Ces résultats suggèrent que les protéines sarcomères recombinantes myosine et actine seules en présence des peptides peuvent ne pas être suffisantes pour avoir un impact sur l'activité ATPase afin de permettre la fonction sarcomère. Au lieu de cela, les peptides cMyBP-C ne pourraient devenir fonctionnels et améliorer l'activité ATPase in vitro qu'en présence d'une architecture de sarcomère plus développée et intacte.

Les peptides cMyBP-C n'ont aucun effet sur le dosage de l'ATPase à l'état d'équilibre avec cMyBP-C C0C2 tronqué ou FL cMyBP-C. (A) La cMyBP-C FL déphosphorylée a inhibé l'activité de la myosine ATPase plus que l'inhibition de la myosine par la cMyBP-C phosphorylée. (B) Les peptides cMyBP-C 302A ou 302S n'ont eu aucun effet sur l'activité myosine ATPase FL cMyBP-C. (C) La cMyBP-C C0-C2 déphosphorylée a inhibé l'activité de la myosine ATPase, mais pas la cMyBP-C phosphorylée. (D) Les peptides cMyBP-C 302A ou 302S n'ont eu aucun effet sur l'activité ATPase de la myosine CO-C2. Les données représentent la moyenne ± SEM (N = 4–12). FL, pleine longueur. Scr, brouillé.

Pour examiner plus en détail le rôle de cMyBP-C sur l'activité ATPase avec un sarcomère intact, nous avons isolé des myofibrilles d'échantillons cardiaques de rats fictifs et de rats post-IM de la semaine 1 chez lesquels des protéines de sarcomère sont présentes à l'état natif. En utilisant l'électrophorèse sur gel, l'intégrité du sarcomère entièrement intact a été confirmée en vérifiant la présence de toutes les protéines myofibrillaires clés, y compris le CMH, cMyBP-C, l'actinine, la troponine T, l'α-tropomyosine, ainsi que les protéines de la chaîne légère de la myosine (MLC) ( Figure supplémentaire S10A). Nous avons observé une réduction constante de la phosphorylation de cMyBP-C p273, p282 et p302 dans les myofibrilles à partir de la semaine 1 après l'IM par rapport aux myofibrilles isolées d'animaux fictifs (Figs supplémentaires S10B – D, S11), sans changer les autres principaux protéines de sarcomère (Fig. S10E, F supplémentaire). Nous avons ensuite évalué les effets des peptides cMyBP-C dans le test ATPase myofibrillaire, dans lequel les peptides peuvent interagir avec des protéines de sarcomère intactes (Fig. 4). Une réduction significative de l'activité de la myosine ATPase a été observée dans les protéines myofibrillaires isolées de la région de l'infarctus MI par rapport aux protéines myofibrillaires isolées des régions factices ou distantes MI (simulacre 159,8 ± 12,59 vs MI distant 144,1 ± 9,81 vs MI infarctus 67,8 ± 12,18 , p < 0,005, figure 4A). Pendant ce temps, aucun des peptides (brouillés, 302A ou 302S) n'a montré d'effet sur les protéines myofibrillaires des cœurs fictifs (Fig. 4B). À l'inverse, les peptides cMyBP-C 302A et 302S ont amélioré l'activité maximale de l'ATPase dans les myofibrilles des cœurs infarcis à la semaine 1 post-IM de 60,9 ± 5,3 nmol Pi/min/mg (fictif, n = 15) à 87,9 ± 7,1 nmol Pi/ min/mg (302A, n = 12 ; p < 0,05) et 91,3 ± 6,2 nmol Pi/min/mg (302S, n = 12 ; p < 0,05), respectivement (Fig. 4C).

L'activité ATPase de la myofibrille a été augmentée par les peptides cMyBP-C 302A et 302S à la semaine 1 chez les rats post-IM, mais pas chez les rats fictifs. (A) L'activité ATPase a été réduite de plus de 50 % dans les myofibrilles de la zone d'infarctus MI, mais inchangée dans les myofibrilles de la zone distante MI par rapport aux myofibrilles de cœurs fictifs (à gauche). L'activité de la myofibrille ATPase a été normalisée par la protéine myofibrille utilisée dans le dosage. L'activité ATPase maximale à pCa 2,0 a été tracée dans le graphique à barres (au milieu). Le pCa50 a également été tracé pour tester la sensibilité au calcium (à droite). (B) Les peptides cMyBP-C 302A et 302S n'ont pas modifié l'activité maximale de l'ATPase dans les myofibrilles isolées de rats fictifs (gauche et milieu). Aucun changement dans la sensibilité au calcium n'a été noté dans aucun des groupes de traitement dans les échantillons fictifs (à droite). (C) Les peptides cMyBP-C 302A et 302S ont augmenté l'activité maximale de l'ATPase dans les myofibrilles isolées de la zone d'infarctus des rats post-IM de la semaine 1 par rapport au contrôle non traité et aux myofibrilles traitées avec des peptides brouillés (gauche et milieu). Aucun changement n'a été noté dans la sensibilité au calcium dans aucun des groupes de traitement dans les échantillons MI (à droite). Les données représentent la moyenne ± SEM (N = 8–15) ; *p < 0,05 ; ***p < 0,005 ; ANOVA unidirectionnelle avec post-test de Tukey. IM, infarctus du myocarde.

Ensuite, nous avons étudié l'activité ATPase et le rôle de cMyBP-C dans les myofibrilles isolées à partir de modèles de souris transgéniques cMyBP-C AAA et DDD (Fig. 5). L'activité de la myosine ATPase était significativement régulée positivement dans les myofibrilles de souris DDD (131,2 ± 9,33 nmol Pi/min/mg) par rapport aux myofibrilles de NTG (93,98 ± 7,85 nmol Pi/min/mg, p < 0,01) et AAA (71,06 ± 6,25 nmol Pi /min/mg) souris (Fig. 5A). Conformément aux données factices, aucun des peptides (brouillés, 302A et 302S) n'a amélioré l'activité ATPase dans les myofibrilles de souris NTG (Fig. 5B). D'autre part, les peptides 302A et 302S ont montré une augmentation de l'activité ATPase maximale de 62,74 ± 4,27 nmol Pi/min/mg (témoin, n = 11) et 58,58 ± 6,67 nmol Pi/min/mg (brouillé, n = 10) à 94,29 ± 11,01 nmol Pi/min/mg (302A, n = 10) et 95,05 ± 10,02 nmol Pi/min/mg (302S, n = 10), représentant une augmentation de 61 % (302A) et 62 % (302S) par rapport au brouillage , respectivement (Fig. 5C). Ni le cMyBP-C 302A ni le peptide 302S n'ont affecté la sensibilité au calcium dans les modèles d'IC précliniques MI ou AAA.

Effet des peptides cMyBP-C 302A et 302S chez les souris NTG et TG. (A) L'activité ATPase est plus élevée chez les souris DDD TG que chez les souris NTG. L'activité ATPase a diminué chez les souris AAA TG (à gauche). L'activité maximale de l'ATPase à pCa 2,0 a été tracée dans le graphique à barres (au milieu). Le pCa50 a également été tracé pour tester la sensibilité au calcium (à droite). (B) Ni le peptide cMyBP-C 302A ni le 302S n'ont modifié l'activité maximale de l'ATPase dans les myofibrilles isolées de souris fictives (gauche et milieu). Aucun changement n'a été noté dans la sensibilité au calcium dans aucun des groupes de traitement dans les échantillons fictifs (à droite). (C) Les peptides cMyBP-C 302A et 302S ont augmenté l'activité maximale de l'ATPase dans les myofibrilles isolées des souris transgéniques par rapport aux myofibrilles témoins non traitées ou traitées aux peptides brouillés (gauche et milieu). Aucun changement dans la sensibilité au calcium n'a été noté dans aucun des groupes de traitement dans les échantillons de TG (à droite). Les données représentent la moyenne ± SEM (N = 8–15) ; *p < 0,05 ; ***p < 0,005 ; ANOVA unidirectionnelle avec post-test de Tukey. TG, souris transgéniques.

Nous avons étendu les découvertes des myofibrilles pour étudier le muscle papillaire qui serait plus proche de l'état in vivo afin de déterminer si les peptides synthétiques cMyBP-C pourraient avoir un impact sur la fonction du sarcomère. Pour ce faire, la relation pCa-force a été mesurée dans les muscles papillaires des cœurs de souris AAA et DDD à l'âge de 3 mois par rapport aux témoins NTG appariés selon l'âge (Fig. 6). Par rapport aux fibres NTG et DDD, nous avons constaté que les fibres AAA présentaient un déficit significatif du développement de la force maximale à pCa 4, 5, ainsi qu'une diminution significative de la sensibilité au calcium, suggérant des déficits mécaniques au niveau des myofilaments (Fig. 6A – E). Conformément aux mesures de l'activité myofibrille ATPase, l'incubation avec 25 µM ou 50 µM de peptide 302S a considérablement amélioré la production de force dans les fibres papillaires AAA, tandis que le peptide 302A a également augmenté la force, mais pas de manière significative (p = 0,0514) (Fig. 6D, Fig. S12A supplémentaire ). Les peptides 302S et 302A ont montré une efficacité significative dans l'amélioration de la sensibilité au calcium dans les fibres AAA (Fig. 6E, Fig. S12B supplémentaire). Nous avons également testé un peptide phospho-mimétique cMyBP-C 302D, qui n'a entraîné aucune amélioration de la production de force dans les fibres papillaires NTG, AAA ou DDD (Fig. S13 supplémentaire). Pour mieux caractériser les effets des peptides 302A et 302S sur la fonction cardiaque, nous avons effectué une mesure du taux de redéveloppement de la force (ktr) comme mesure indirecte de la relaxation. Le peptide 302A, mais pas le 302S, a amélioré l'activité ktr, indiquant que cette dernière n'affecte que la contractilité, pas la relaxation (Fig. 6F). Les effets améliorés sur ktr ont également été observés avec le peptide 302A à 25 µM (Fig. S12C supplémentaire).

La fonction cardiaque a été améliorée par les peptides cMyBP-C 302A et 302S dans les fibres musculaires isolées de souris transgéniques AAA, mais pas chez les souris NTG ou DDD TG. Courbes Force pCa (A–C) générées à une longueur de sarcomère de 2,0 μM en présence de différents peptides (50 μM). La production de force maximale (D, mN/mm2), la sensibilité au calcium (E, pCa50) et le taux de régénération de force (F, ktr ) ont été mesurés en présence de différents peptides (50 μM) dans NTG (barre blanche), AAA ( barre rouge) et DDD (barre verte). N = 4 fibres papillaires par traitement peptidique à partir de 4 animaux par groupe. *p < 0,05 ANOVA unidirectionnelle avec post-test de Tukey. AAA, alanines non phosphorylées ; DDD, acides aspartiques phospho-mimétiques ; NTG, souris non transgéniques. Scr, brouillé.

cMyBP-C est un régulateur clé de la contractilité cardiaque avec plus de 300 mutations dans le gène MYBPC3 directement liées au développement de la cardiomyopathie et de l'insuffisance cardiaque22,23. Bien qu'il ait été démontré que la phosphorylation de cMyBP-C diminue de manière significative dans des conditions pathologiques dans des modèles précliniques et cliniques, le changement dynamique de l'expression de cMyBP-C et son importance dans la cinétique cardiaque à différents moments n'ont pas été rapportés. Dans cette étude, nous avons caractérisé la dynamique de la déphosphorylation de cMyBP-C au cours du développement de HF dans un modèle d'IM chez le rat. La phosphorylation de cMyBP-C a diminué de manière significative en 1 semaine (les jours 1 et 3 après l'IM, Fig. 1) après une lésion cardiaque, mais a augmenté de manière significative à des moments ultérieurs (semaine 4 et semaine 8 après l'IM, Fig. S2 supplémentaire) , suggérant un effet compensateur au niveau du cœur. La cMyBP-C totale a également diminué à différents moments dans le modèle HF préclinique MI. Ces résultats suggèrent que l'état de phosphorylation de cMyBP-C est temporel et, lorsqu'il est combiné à une diminution de l'expression totale de cMyBP-C, contribue au développement de l'IC. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse de l'utilité de stratégies d'intervention ciblant cMyBP-C dans son état déphosphorylé pathogène à des moments pertinents sur la base de nos découvertes à partir de modèles animaux précliniques. La perte aiguë de cMyBP-C totale dans la circulation sanguine est cohérente avec les études précédentes, suggérant que cMyBP-C pourrait servir de biomarqueur diagnostique potentiel de l'IDM et de marqueur pronostique de HF24. Chez les patients humains HCM et DCM, la phosphorylation de cMyBP-C est liée au développement de la progression de la maladie25,26. Chez les patients HCM, p273 et p282 ont été réduits (Fig. 2). La hiérarchie des sites de phosphorylation de cMyBP-C a été rapportée20. Ser-282 a un rôle régulateur unique en ce que sa phosphorylation est essentielle pour la phosphorylation ultérieure de Ser-302. En ce qui concerne son importance dans la fonction cMyBP-C, nous avons observé une diminution de la phosphorylation de ser-282 chez les patients DCM et HCM (Fig. 2). Ser-273 est phosphorylé à la fois par la protéine kinase A (PKA) et la protéine kinase C (PKC), contrairement au ser-282 qui est principalement phosphorylé par PKA et CAMKII sous des concentrations de calcium non physiologiques. Chez les patients DCM, il existe une possibilité de compensation de la dynamique PKA et/ou PKC qui pourrait avoir un impact sur la phosphorylation de ser 273. Par conséquent, cela pourrait avoir un effet minime chez les patients DCM et non HCM. Ser-282 et ser-302 sont impliqués dans l'accélération de la cinétique de cMyBP-C et sont phosphorylés par CAMKII. Il a été démontré que l'ablation de la phosphorylation de ser282 diminue la phosphorylation de ser-302 par CAMKII. Bien que p302 n'ait pas été examiné en raison d'échantillons de patients limités, nos données ont indiqué que différents sites de phosphorylation pourraient être impactés chez les patients HCM et DCM.

La phosphorylation réduite de cMyBP-C a été liée à une contractilité compromise chez les patients souffrant d'insuffisance cardiaque27. Ici, nous avons utilisé les peptides cMyBP-C 302A et 302S21 publiés précédemment, des substituts de la sérine 302 du site de phosphorylation réglementaire, comme outil pour déterminer si la modulation de l'état de déphosphorylation de cMyBP-C peut améliorer la contraction et la relaxation cardiaques dans l'insuffisance cardiaque expérimentale (IC). des modèles. Par conséquent, pour caractériser pleinement les effets des peptides sur la modulation de cMyBP-C, nous avons évalué les peptides dans trois différents tests recombinants in vitro et ex vivo : un test d'ATPase à l'état d'équilibre, un test d'ATPase myofibrille et un test de muscle papillaire. Dans le test ATPase à l'état d'équilibre, aucun changement dans l'activité ATPase n'a été observé dans aucun des groupes de traitement (Fig. 3). Cependant, lorsque les protéines myofibrilles ont été isolées à partir de modèles malades, c'est-à-dire le modèle MI de rat ou le modèle cMyBP-CAAA de souris, une amélioration constante de l'activité ATPase a été observée dans les groupes traités aux peptides 302S et 302A (Figs. 4, 5). Cette amélioration de l'activité ATPase était cohérente avec l'amélioration de la contractilité à l'aide de fibres musculaires papillaires isolées de souris transgéniques cMyBP-CAAA (Fig. 6). Ensemble, ces données ont montré la nécessité d'évaluer les thérapies ciblées sur cMyBP-C dans des conditions pathologiques. De plus, les découvertes ci-dessus suggèrent fortement l'exigence d'un sarcomère intact pour que l'activité des peptides capture correctement la cinétique de cMyBP-C et son rôle dans la modulation de la fonction cardiaque. La perméabilité limitée des peptides a rendu impossible l'immunolocalisation des peptides sur des myocytes cardiaques intacts ou des sarcomères.

Puisque nous avons observé les effets cardiaques améliorés des peptides sur les modèles HF qui avaient montré une expression ou une phosphorylation réduite de cMyBP-C, nous avons émis l'hypothèse que les peptides interrompaient probablement l'interaction de cMyBP-C et de la myosine, améliorant ainsi l'interaction de la tête de myosine avec le filament fin et, par conséquent, coup de puissance. Dans des conditions physiologiques (NTG / DDD ou normales), la cMyBP-C phosphorylée facilite l'activation du cycle des ponts croisés, attachant les filaments sarcomériques épais et fins (Fig. 7; panneau de gauche). Cependant, lorsque la cMyBP-C se déphosphoryle dans des conditions pathologiques (AAA ou HF), elle interagit fortement avec la myosine, empêchant ainsi son interaction génératrice de force avec l'actine (Fig. 7 ; panneau du milieu). Les peptides cMyBP-C que nous avons testés pourraient perturber l'interaction étroite entre cMyBP-C et la myosine, libérant les filaments épais pour reprendre leur interaction avec les filaments fins afin d'améliorer la contractilité musculaire (Fig. 7 ; panneau de droite).

Diagramme montrant l'effet de l'état de phosphorylation de cMyBP-C sur l'interaction de l'actomyosine par rapport à l'effet des peptides cMyBP-C 302A et 302S dans le contexte de la formation de ponts croisés. En l'absence de phosphorylation (en haut), la position du site de liaison à l'actine de cMyBP-C se situerait à environ 3 nm du filament fin. La phosphorylation de cMyBP-C (milieu) étendrait le pont croisé à la surface du filament mince et desserrerait ainsi l'emballage de la partie tige de la molécule de myosine. Le peptide 302A perméabilisant empêche la myosine d'interagir avec cMyBP-C (en bas), entraînant son mouvement vers l'actine, qui à son tour entraîne la formation d'interactions et de ponts croisés avec l'actomyosine, améliorant ainsi la contractilité.

La pertinence de la phosphorylation de cMyBP-C a été rapportée dans plusieurs modèles de rongeurs transgéniques en remplaçant la sérine des sites de phosphorylation pour imiter cMyBP-C activé, comme le modèle de souris transgénique DDD18,19. La réduction des sites de phosphorylation dans cMyBP-C peut contribuer à une diminution de l'expression des protéines. Ici, nous avons observé qu'une telle phosphorylation réduite était corrélée à une expression totale réduite de cMyBP-C (Fig. 1). Récemment, des études ont fait état de l'apport d'ADNc de MYBPC3 pour améliorer la fonction cardiaque. Il a été rapporté qu'une seule dose systémique d'ADNc de MYBPC3 porteur d'AAV9 était capable de restaurer les niveaux d'ARNm et de protéines de MYBPC3 et d'empêcher le développement de l'hypertrophie ventriculaire gauche (HVG) chez des souris knock-in ciblées par MYBPC3 avec seulement 20 % de cMyBP-C protéine28. Une autre étude a rapporté que l'ADNc de MYBPC3 porteur d'AAV6 était capable d'obtenir une amélioration similaire dans le tissu cardiaque 3D modifié29,30. De plus, il a été démontré que l'ADNc de MYBPC3 porteur d'AAV9 supprime le développement de l'hypertrophie dans les cardiomyocytes humains dérivés d'iPSC de patients HCM31. Cependant, l'utilisation soutenue de l'AAV9 en tant que thérapie pourrait présenter des inconvénients en raison du manque de connaissances sur la disposition cellulaire et du corps entier, la relation dose-exposition et la relation exposition-réponse, ainsi que l'effet de l'immunogénicité sur ces propriétés importantes32. Par conséquent, la recherche de molécules spécifiques ciblant cMyBP-C et son interaction protéine-protéine est essentielle pour apporter une thérapie efficace du laboratoire au chevet du patient. Notre étude a été limitée par la faible perméabilité et stabilité des peptides cMyBP-C, limitant nos essais aux paramètres in vitro et ex vivo dans lesquels nous avons utilisé des protéines myofibrilles et des fibres musculaires papillaires perméabilisées. Ainsi, d'autres études dans un cadre in vivo avec des peptides perméables et une bonne stabilité permettraient une compréhension plus complète du ou des mécanismes de modulation de cMyBP-C dans la fonction cardiaque.

Le modèle de rat d'infarctus du myocarde (IM) a déjà été caractérisé33. Vingt-huit rats mâles Sprague-Dawley (SD) (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), âgés de 8 à 10 semaines et pesant de 180 à 250 g, ont été utilisés pour induire un IM par l'artère coronaire descendante antérieure gauche (LAD) ligature. Nous avons suivi les directives ARRIVE tout au long de l'étude pour la manipulation des animaux. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d'éthique institutionnel pour l'utilisation et le soin des animaux de laboratoire chez Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA. En bref, les animaux ont subi une thoracotomie du côté gauche sous anesthésie. Le sac péricardique a été ouvert et LAD a été identifié. Un obturateur d'artère coronaire a été placé lâchement autour du LAD à ~ 2 mm sous l'origine, puis l'obturateur a été tiré pour ligaturer l'artère coronaire. L'infarctus était défini par le blanchiment et la décoloration du ventricule gauche et l'élévation du segment ST à l'ECG. Ensuite, le coffre a été fermé. Les animaux ont été étroitement surveillés pour les complications chirurgicales post-opératoires. Vingt-trois rats SD mâles d'âge et de poids corporel similaires ont été désignés comme animaux fictifs ayant reçu une thoracotomie similaire pour accéder au cœur et à la fermeture de la plaie, mais sans ligature LAD. L'évaluation post-IM pour confirmer les infarctus a été réalisée par échocardiographie au jour 3, à la semaine 1, à la semaine 4 et à la semaine 8. Parallèlement, les paramètres fonctionnels cardiaques globaux suivants ont été mesurés : diamètre interne VG télésystolique et diastolique (mm), diamètre VG télésystolique et diastolique volume diastolique (µL), volume d'éjection systolique (µL), débit cardiaque (mL/min) et fréquence cardiaque (BPM) (Fig. S1 supplémentaire). Les animaux avec un infarctus de petite taille et une fraction d'éjection (FE) > 40 % ont été exclus de l'étude. Les quatre points de temps d'arrêt étaient le jour 3, la semaine 1, la semaine 4 et la semaine 8. À chaque point de temps d'arrêt, les rats ont été anesthésiés et les cœurs ont été excisés, congelés instantanément dans de l'azote liquide et stockés à - 80 ° C jusqu'à utilisation. .

Des modèles de souris transgéniques transgéniques phospho-ablés (AAA) et phospho-mimétiques (DDD) précédemment décrits de cMyBP-C avec le promoteur de chaîne lourde α-myosine ont été utilisés pour générer plusieurs lignées de souris FVB/N18,19,34,35. En bref, les sites de phosphorylation clés connus (Ser-273, Ser-282 et Ser-302) sur cMyBP-C et deux sites de phosphorylation potentiellement alternatifs voisins (Thr-272 et -281) ont été convertis en alanine (A) et en acide aspartique. (D) résidus en utilisant des méthodes standard basées sur la PCR. Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives institutionnelles et approuvées par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Cincinnati. Des souris adultes de sexe mixte âgées de 12 à 14 semaines ont été utilisées dans cette étude.

Les peptides inhibiteurs de cMyBP-C ont été synthétisés dans les laboratoires de recherche de Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA. Tous les peptides ont été caractérisés par spectrométrie de masse à haute résolution pour avoir des valeurs de pureté confirmées proches ou supérieures à 90 % et des valeurs de masse précises conformes à celles attendues sur la base des séquences. Les séquences des quatre peptides originaux utilisés dans cette étude sont répertoriées dans le tableau 121. La pureté et l'analyse de masse précise ont été menées simultanément par LC-UV/MS en phase inverse à l'aide d'un chromatographe liquide Waters ACQUITY I-class (Waters, Milford, MA) interfacé avec un spectromètre de masse Xevo G2-XS QTOF fonctionnant en mode ionisation ESI+. Une phase stationnaire Waters BEH C18, 1,7 μm, 130 Å, 2,1 × 150 mm a été utilisée (pièce n° 186003556) avec 0,1 % d'acide trifluoroacétique dans de l'eau distillée (dH2O) (A) et 0,1 % d'acide trifluoroacétique dans des phases mobiles d'acétonitrile (B). . La colonne a été maintenue isotherme à 55 °C, avec un gradient linéaire de 5 à 55 % de B sur 25 min, en utilisant un débit de 0,4 mL/min.

Le niveau de phosphorylation du domaine M cMyBP-C au niveau de trois résidus sérine (p273, p282, p302) a été déterminé chez des rats SD soumis à une chirurgie MI en utilisant la procédure Western Immunoassay (Wes) (ProteinSimple, Santa Clara, CA). Le tissu d'infarctus du ventricule gauche a été lysé dans un tampon RIPA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) additionné d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase. L'estimation des protéines a été effectuée selon le kit (Pierce™ BCA Protein Assay Kit 23225, Thermo Fisher Scientific). Les échantillons ont été préparés selon le protocole de Wes, selon les recommandations de ProteinSimple. Les anticorps utilisés pour l'étude d'expression sont les suivants : Anti-cMyBP-C p273 (1:250), cMyBP-C p-282 (1:250), cMyBP-C p302 (1:250) (tous fournis dans le cadre d'un accord de transfert de matériel du professeur Sakthivel Sadayappan, Faculté de médecine, Université de Cincinnati); cMyBP-C total (Santa Cruz Cat # SC-137182, Lot # E2913 [1:5 pour Wes]); chaîne lourde de myosine (Abcam ab207926 (3-48G5C7); alpha (cardiaque) actine (Sigma-Aldrich A9357 clone AC1-20.4.2); Troponine I (Cell Signaling 13083S [D6F8]); et Troponine T (Sigma-Aldrich T6277 Clone JLT-12) Les données ont été normalisées aux expressions des protéines domestiques α-actine ou hypoxanthine phosphoribosyl transférase (HPRT) pour correspondre à la quantité de protéine chargée.

Des études IHC ont été réalisées à l'aide de coupes de tissus cardiaques en série de patients humains adultes (sujets normaux, patients HCM et patients DCM). Toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives et réglementations par Nanjing KeyGen BioTech Co., Ltd. et Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. Tous les protocoles expérimentaux ont été réalisés conformément aux directives et réglementations et approuvés par l'hôpital affilié Drum Tower, Medical École de l'Université de Nanjing. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets et/ou de leur tuteur légal par l'hôpital affilié Drum Tower, faculté de médecine de l'université de Nanjing. En bref, des coupes de tissus ont été déparaffinées dans du xylène et réhydratées par des lavages gradués à l'alcool avant d'être incubées avec un bloc de peroxydase (3% H2O2-méthanol) à température ambiante pendant 10 min pour inhiber l'activité endogène de la peroxydase. Après lavage avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), les coupes ont été bloquées avec de l'albumine de sérum bovin à 1 % (BSA, 50-100 μL) à température ambiante pendant 1 h pour empêcher la liaison non spécifique du réactif de détection. Après lavage avec du PBS, les coupes ont été incubées avec l'anticorps primaire (50-100 μL ; anticorps polyclonaux de lapin sur mesure [GenScript, Piscataway, NJ]) : p-273 (AFRRTpSLAGAGC), p282 (GAGRRTpSDSHEDAC) et protéine totale (AFRRTSLAGAGC ) en chambre humide à 4 °C pendant une nuit. Après lavage, les coupes ont ensuite été incubées avec un activateur (50-100 μL) à température ambiante pendant 20 min puis lavées avec du PBS. Les coupes ont ensuite été incubées avec le polymère ImmPRESS HRP PLUS (souris/lapin, Vector Laboratories, Burlingame, CA) à température ambiante pendant 20 min, puis lavées avec du PBS. Un mélange de chromogène 3,3′-diaminobenzidine (DAB) et de substrat a ensuite été ajouté à température ambiante pendant environ 3 à 5 minutes pour permettre un développement correct de la couleur. La réaction a ensuite été terminée en lavant les coupes avec de l'eau. Les coupes ont ensuite été contre-colorées avec de l'hématoxyline pendant 15 minutes et rincées à l'eau. Enfin, les coupes ont été déshydratées dans un rinçage ascendant à l'alcool gradué qui s'est terminé par un lavage au xylène. Un baume neutre a été utilisé pour recouvrir les sections. Les lames colorées ont été imagées avec un microscope à un grossissement de 200 × ou 400 × pour évaluer l'expression des protéines. L'expression positive des phospho-protéines a été déterminée par le rapport de la région positive à la surface totale et normalisée en utilisant les valeurs de l'expression totale des protéines.

Un essai d'ATPase à l'état d'équilibre a été effectué en mesurant la libération de phosphate inorganique à l'aide de la méthode colorimétrique. La réaction ATPase a été réalisée dans un tampon de réaction composé de Tris-HCl 15 mM, pH 7,5, KCl 10 mM, MgCl2 2 mM et EGTA 0,1 mM. La myosine et les domaines FL cMyBP-C et C0-C2 ont été fabriqués dans les laboratoires de recherche de Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA, avec des modifications selon les références36,37. L'actine a été fabriquée à partir de muscle squelettique de lapin, avec des modifications mineures, dans les mêmes laboratoires de recherche38,39. Toutes les protéines utilisées dans le test ont été diluées dans un tampon de réaction. Une réaction de 30 µL a été mise en place en ajoutant FL ou cMyBP-C tronqué (C0-C2), myosine (1 µM), F-actine (10 µM) et ATP (2 mM). La F-actine a été préparée à partir de la G-actine en ajoutant 50 mM de KCl et 2 mM de MgCl2, suivi d'un bref vortex et d'une incubation de 30 minutes sur de la glace pour la polymérisation. La plaque a été centrifugée à 2 000 tr/min pendant 15 s pour aider à réduire les bulles, et la plaque de réaction a été incubée à 37 °C sous agitation constante pendant 60 min. La réaction a été arrêtée en diluant les protéines (1:20) dans l'eau. 30 µL du mélange réactionnel 1:20 ont été transférés sur une nouvelle plaque et de l'eau a été ajoutée pour compléter jusqu'à 200 µL selon les instructions du kit (Abcam ab65622, Waltham, MA). Les étalons de phosphate ont également été préparés selon les instructions du kit. Enfin, 30 µL de réactif de détection ont été ajoutés à tous les puits standard et d'échantillon, incubés à température ambiante pendant 30 min avec agitation constante, puis lus à un point final de 650 nm dans SpectraMax (Molecular Devices, San Jose, CA).

L'activité ATPase myofibrillaire a été déterminée en mesurant la libération de phosphate inorganique40. Les protéines myofibrillaires ont été isolées et purifiées, comme indiqué précédemment41,42, et mises en suspension dans un tampon F60 avec 500 mM de NaCl. Ces protéines ont été extraites d'échantillons de cœur de rat post-IM et simulés de la semaine 1, ainsi que d'échantillons de cœur de souris transgéniques cMyBP-C (NTG, AAA et DDD). La protéine a ensuite été déterminée par coloration au bleu de Coomassie (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) de gels SDS-PAGE (Fig. S10 supplémentaire). Le mélange réactionnel contenait 0,25 à 0,5 mg/mL de protéines myofibrillaires, 15 mM de Tris-HCl, 10 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 0,5 mM d'EGTA et 5 mM d'ATP (pH 7,0). Les dosages ont été effectués dans une plaque de microtitration à 96 puits à des concentrations de pCa2+ (pCa) de 8,0 à 2,0 à 37 °C. Le mélange réactionnel de 120 µL a été incubé à 37 °C pendant 15 min et centrifugé à 1500 tr/min pendant 3 min. Chaque 30 µL de surnageant a été transféré dans une nouvelle plaque de microtitration à 96 puits et mélangé avec 170 µL d'eau distillée (dH2O). Un réactif de détection de 30 µL (Phosphate Assay Kit, Abcam) a été ajouté pour créer une réaction de développement de la couleur, après quoi la production de phosphate inorganique a été déterminée par calorimétrie à 625 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques cinétiques (Molecular Devices). L'activité ATPase stimulée par le calcium a été calculée en soustrayant l'activité à pCa 2,0 de l'activité à pCa 8,0.

Des cœurs entiers ont été rapidement excisés et lavés avec du tampon 1 × Krebs – Henseleit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), suivi de l'ajout de 1 g de d-glucose, 0,84 g de NaHCO3 et 0,76 g de BDM. Chaque cœur a été coupé pour exposer soigneusement les muscles papillaires du VG. Comme décrit précédemment34, les muscles papillaires ont été excisés sous un microscope à dissection (V8 Stereo, PlanAPO S 0,63× FWD 81 mm, Zeiss, Dublin, CA) et perméabilisés pendant une nuit dans du Triton X-100 à 1 % prédilué à 10 % dans une solution relaxante de montage ( KOH 97,92 mM, ATP 6,24 mM, EGTA 10 mM, Na2CrP 10 mM, propionate de potassium 47,58 mM, BES 100 mM, MgCl2 6,54 mM et DTT 1 mM) à 4 oC pour éliminer la membrane cellulaire et les protéines liées à la membrane. Les muscles papillaires ont ensuite été découpés en faisceaux de fibres d'environ 1 mm de longueur sous le microscope à dissection. Des faisceaux de fibres droites ont été sélectionnés en fonction de leur uniformité et ont ensuite été attachés à chaque extrémité avec des clips en T en aluminium. Chaque faisceau de fibres a été délicatement lavé avec une solution relaxante fraîche sur de la glace et utilisé dans les 12 h. Les fibres coupées en T ont ensuite été attachées à un transducteur de force et à un contrôleur de longueur à grande vitesse (Aurora Scientific, Inc., Aurora, ON, Canada). Les dimensions musculaires (section transversale, longueur) ont été déterminées à l'aide d'un micromètre oculaire monté sur le microscope à dissection (résolution, ~ 10 μM). Ces dimensions musculaires ont été utilisées pour normaliser la force contractile et la longueur du sarcomère. Ce dernier a été fixé à 2,0 μM et a été surveillé en continu par le système de mesure de longueur de sarcomère vidéo à grande vitesse (HVSL) d'Aurora. La force et la diminution de l'attachement des fibres musculaires ont été déterminées en exposant les fibres attachées à la solution d'activation saturant le maximum de calcium au début et à la fin du protocole expérimental. La force isométrique en développement a été enregistrée à différentes concentrations de calcium (pCa de 10,0 à 4,5) en présence ou en l'absence de peptides, et le niveau de force de référence zéro a été soustrait de tous les enregistrements de force à chaque cycle d'activation. Toutes les mesures de force ont été corrigées pour le délabrement et normalisées à la surface de la section transversale. Les fibres avec plus de 20 % de dégradation ont été exclues de l'analyse des données. Les données ont été acquises à l'aide du système d'acquisition et d'analyse de données musculaires en temps réel 600A d'Aurora. Chaque relation force-calcium individuelle a été ajustée à une équation de Hill modifiée (Force/Forcemax = [Ca2+]n/(pCa50n + [Ca2+]n) dans laquelle n est la pente de Hill. De même, le taux de redéveloppement de la tension (ktr) a été également mesuré dans les fibres récoltées à partir de tissu cardiaque AAA, DDD et NTG à pCa 4,5.

Toutes les données sont représentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM), sauf indication contraire. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide de GraphPad Prism (v 6.0, GraphPad Software, San Diego, CA). Les données ont été analysées à l'aide d'une ANOVA à deux voies avec le test post-hoc de Tukey. Une valeur p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Alanines non phosphorylées

Cardiomyopathie dilatée

Acides aspartiques phospho-mimétiques

Eau distillée

Volume télédiastolique

La fraction d'éjection

Volume systolique final

Force

Isothiocyanate de fluorescéine

Toute la longueur

Cardiomyopathie hypertrophique

Gène hypoxanthine phosphoribosyl transférase

Cellules souches pluripotentes induites par l'homme

Taux de réaménagement de la force

Diastole de fin de diamètre interne du ventricule gauche

Systole de fin de diamètre interne ventriculaire gauche

Chaîne lourde de myosine

Infarctus du myocarde

Chaîne légère de myosine

Non transgénique

α-tropomyosine

Troponine T

Troponine I

Offer, G., Moos, C. & Starr, R. Une nouvelle protéine des filaments épais des myofibrilles squelettiques des vertébrés. Extractions, purification et caractérisation. J. Mol. Biol. 74, 653–676. https://doi.org/10.1016/0022-2836(73)90055-7 (1973).

Article CAS PubMed Google Scholar

Winegrad, S. Protéine de liaison à la myosine cardiaque C. Circ. Rés. 84, 1117-1126. https://doi.org/10.1161/01.res.84.10.1117 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Winegrad, S. Myosin binding protein C, un régulateur potentiel de la contractilité cardiaque. Circ. Rés. 86, 6–7. https://doi.org/10.1161/01.res.86.1.6 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Weisberg, A. & Winegrad, S. Altération des ponts croisés de myosine par phosphorylation de la protéine C de liaison à la myosine dans le muscle cardiaque. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 93, 8999–9003. https://doi.org/10.1073/pnas.93.17.8999 (1996).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barefield, D. & Sadayappan, S. Phosphorylation et fonction de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque dans la santé et la maladie. J. Mol. Cellule Cardiole. 48, 866–875. https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2009.11.014 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jacques, AM et al. Phosphorylation de la protéine C de liaison à la myosine dans le muscle cardiaque humain normal, hypertrophique et défaillant. J. Mol. Cellule Cardiole. 45, 209–216. https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2008.05.020 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jia, W., Shaffer, JF, Harris, SP & Leary, JA Identification de nouveaux sites de phosphorylation de la protéine kinase A dans le domaine M de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque humaine et murine à l'aide d'une analyse par spectrométrie de masse. J. Proteome Res. 9, 1843–1853. https://doi.org/10.1021/pr901006h (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kooij, V., Holewinski, RJ, Murphy, AM et Van Eyk, JE Caractérisation du phosphoprotéome de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque dans les cœurs humains sains et défaillants. J. Mol. Cellule Cardiole. 60, 116–120. https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2013.04.012 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sadayappan, S. & de Tombe, PP Protéine C de liaison à la myosine cardiaque : redéfinition de sa structure et de sa fonction. Biophys. Rév. 4, 93–106. https://doi.org/10.1007/s12551-012-0067-x (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Harris, SP, Rostkova, E., Gautel, M. & Moss, RL La liaison de la protéine C de liaison à la myosine au sous-fragment de myosine S2 affecte la contractilité indépendamment d'un mécanisme d'attache. Circ. Rés. 95, 930–936. https://doi.org/10.1161/01.RES.0000147312.02673.56 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ponnam, S., Sevrieva, I., Sun, YB, Irving, M. & Kampourakis, T. La phosphorylation spécifique au site de la protéine C de liaison à la myosine coordonne l'activation des filaments minces et épais dans le muscle cardiaque. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis https://doi.org/10.1073/pnas.1903033116 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Levine, R., Weisberg, A., Kulikovskaya, I., McClellan, G. & Winegrad, S. Structures multiples de filaments épais dans le muscle cardiaque au repos et leur influence sur les interactions entre les ponts. Biophys. J. 81, 1070-1082. https://doi.org/10.1016/S0006-3495(01)75764-5 (2001).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hofmann, PA, Greaser, ML & Moss, RL La protéine C limite la vitesse de raccourcissement des fibres musculaires squelettiques du lapin à de faibles niveaux d'activation du Ca2+. J. Physiol. 439, 701–715. https://doi.org/10.1113/jphysiol.1991.sp018689 (1991).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stelzer, JE, Patel, JR & Moss, RL L'accélération médiée par la protéine kinase A de la réponse d'activation de l'étirement dans le myocarde à peau murine est éliminée par l'ablation de cMyBP-C. Circ. Rés. 99, 884–890. https://doi.org/10.1161/01.RES.0000245191.34690.66 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Colson, BA et al. La phosphorylation médiée par la protéine kinase A de cMyBP-C augmente la proximité des têtes de myosine avec l'actine dans le myocarde au repos. Circ. Rés. 103, 244–251. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.108.178996 (2008).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Witayavanitkul, N. et al. Le fragment N-terminal induit par l'infarctus du myocarde de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque (cMyBP-C) altère la fonction du myofilament dans le myocarde humain. J. Biol. Chim. 289, 8818–8827. https://doi.org/10.1074/jbc.M113.541128 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rosas, PC et al. La phosphorylation de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque est un médiateur essentiel de la fonction diastolique. Circ. Échec cardiaque. 8, 582–594. https://doi.org/10.1161/CIRCHEARTFAILURE.114.001550 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sadayappan, S. et al. Phosphorylation de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque et fonction cardiaque. Circ. Rés. 97, 1156-1163. https://doi.org/10.1161/01.RES.0000190605.79013.4d (2005).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sadayappan, S. et al. La phosphorylation de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque est cardioprotectrice. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 103, 16918–16923. https://doi.org/10.1073/pnas.0607069103 (2006).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sadayappan, S. et al. Une fonction critique pour Ser-282 dans la phosphorylation de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque et la fonction cardiaque. Circ. Rés. 109, 141-U146. https://doi.org/10.1161/Circresaha.111.242560 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Richard, L. & Moss, AF Inhibition de la liaison de MyBP-C à la myosine comme traitement de l'insuffisance cardiaque. Brevet américain US 9 051 387 B2 (2015).

Carrier, L., Mearini, G., Stathopoulou, K. & Cuello, F. Protéine C de liaison à la myosine cardiaque (MYBPC3) en physiopathologie cardiaque. Gène 573, 188–197. https://doi.org/10.1016/j.gene.2015.09.008 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Behrens-Gawlik, V., Mearini, G., Gedicke-Hornung, C., Richard, P. & Carrier, L. MYBPC3 dans la cardiomyopathie hypertrophique : de l'identification des mutations à la correction basée sur l'ARN. Arc Pflugers. 466, 215–223. https://doi.org/10.1007/s00424-013-1409-7 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Govindan, S. et al. La protéine C de liaison à la myosine cardiaque est un biomarqueur diagnostique potentiel de l'infarctus du myocarde. J. Mol. Cellule Cardiole. 52, 154–164. https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2011.09.011 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Copeland, O. et al. Analyse de la phosphorylation de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque dans le muscle cardiaque humain. J. Mol. Cellule Cardiole. 49, 1003–1011. https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2010.09.007 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

van Dijk, SJ et al. Un morceau du cœur humain : variation de la phosphorylation des protéines dans des échantillons ventriculaires gauches de patients atteints de cardiomyopathie primaire en phase terminale. J. Muscle Res. Motil cellulaire. 30, 299-302. https://doi.org/10.1007/s10974-010-9205-x (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

El-Armouche, A. et al. Diminution des niveaux de phosphorylation de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque dans l'insuffisance cardiaque humaine et expérimentale. J. Mol. Cellule Cardiole. 43, 223–229. https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2007.05.003 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mearini, G. et al. La thérapie génique Mybpc3 pour la cardiomyopathie néonatale permet la prévention à long terme de la maladie chez la souris. Nat. Commun. 5, 5515. https://doi.org/10.1038/ncomms6515 (2014).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Wijnker, PJ et al. Comparaison des effets d'une mutation tronquée et d'une mutation faux-sens de MYBPC3 sur les paramètres contractiles du tissu cardiaque modifié. J. Mol. Cellule Cardiole. 97, 82–92. https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2016.03.003 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Dutsch, A. et al. La protéine C de liaison à la myosine cardiaque phosphomimétique sauve partiellement un phénotype de cardiomyopathie dans le tissu cardiaque modifié murin. Sci. Rep. 9, 18152. https://doi.org/10.1038/s41598-019-54665-2 (2019).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Prondzynski, M. et al. Évaluation du trans-épissage et du remplacement du gène MYBPC3 comme options thérapeutiques dans les cardiomyocytes humains dérivés d'iPSC. Mol. Là. Acides nucléiques 7, 475–486. https://doi.org/10.1016/j.omtn.2017.05.008 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chowdhury, EA et al. Progrès et limites actuels de l'administration de gènes thérapeutiques protéiques par l'AAV et importance du développement de modèles pharmacocinétiques/pharmacodynamiques (PK/PD) quantitatifs. Adv. Déliv. Rév. 170, 214–237. https://doi.org/10.1016/j.addr.2021.01.017 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, MH et McConnell, BK Infarctus aigu du myocarde chez le rat. J.Vis. Exp. https://doi.org/10.3791/2464 (2011).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Kumar, M. et al. La protéine C de liaison à la myosine cardiaque et la phosphorylation de la troponine-I modulent indépendamment l'activation dépendante de la longueur du myofilament. J. Biol. Chim. 290, 29241–29249. https://doi.org/10.1074/jbc.M115.686790 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McNamara, JW, Singh, RR & Sadayappan, S. La phosphorylation de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque régule l'état super détendu de la myosine. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 116, 11731–11736. https://doi.org/10.1073/pnas.1821660116 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nag, S. et al. La mésa de myosine et la base de l'hypercontractilité causée par les mutations de la cardiomyopathie hypertrophique. Nat. Structure. Mol. Biol. 24, 525–533. https://doi.org/10.1038/nsmb.3408 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Trybus, KM Études biochimiques de la myosine. Méthodes 22, 327–335. https://doi.org/10.1006/meth.2000.1085 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Rohde, JA, Thomas, DD & Muretta, JM Le médicament contre l'insuffisance cardiaque modifie la mécanoenzymologie de la course de myosine cardiaque. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 114, E1796–E1804. https://doi.org/10.1073/pnas.1611698114 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Margossian, SS & Lowey, S. Préparation de la myosine et de ses sous-fragments à partir du muscle squelettique du lapin. Méthodes Enzymol. 85(Pt B), 55–71. https://doi.org/10.1016/0076-6879(82)85009-x (1982).

Article CAS PubMed Google Scholar

Krenz, M. et al. Analyse de la fonctionnalité des chaînes lourdes de la myosine dans le cœur. J. Biol. Chim. 278, 17466–17474. https://doi.org/10.1074/jbc.M210804200 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Fewell, JG et al. Signification fonctionnelle de la commutation isoforme de la chaîne légère essentielle de la myosine cardiaque chez les souris transgéniques. J.Clin. Enquête 101, 2630–2639. https://doi.org/10.1172/JCI2825 (1998).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McAuliffe, JJ, Gao, LZ & Solaro, RJ Modifications de l'activation myofibrillaire et de la liaison de la troponine C Ca2+ associées à la commutation de l'isoforme de la troponine T dans le développement du cœur de lapin. Circ. Rés. 66, 1204-1216. https://doi.org/10.1161/01.res.66.5.1204 (1990).

Article CAS PubMed Google Scholar

Télécharger les références

Nous remercions Iffet Armstrong, Research Presentations Designer, Scientific and Medical Education chez Merck Creative Studios pour son aide dans la préparation de l'illustration de la Fig. 7.

Mohit Kumar a été soutenu par une bourse prédoctorale de l'American Heart Association (17PRE33630192). Sakthivel Sadayappan a reçu le soutien des subventions des National Institutes of Health R01 AR078001, R01 HL130356, R38 HL155775 et R01 HL143490 ; American Heart Association 2019 Institutional Undergraduate Student (19UFEL34380251) et Transformation (19TPA34830084) ; et le soutien de Novo Nordisk, Amgen, AstraZeneca, MyoKardia et Merck.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Luqia Hou et Mohit Kumar.

Département cardiométabolique, Merck & Co., Inc., 213 East Grand Ave., South San Francisco, CA, 94080, États-Unis

Luqia Hou, Priti Anand, Yinhong Chen, Nesrine El-Bizri et Gayathri Swaminath

R&D analytique, Merck & Co., Inc., South San Francisco, CA, 94080, États-Unis

Chad J. Pickens

Discovery Chemistry, Merck & Co., Inc., South San Francisco, Californie, 94080, États-Unis

W.Michael Seganish

Division de la santé et des maladies cardiovasculaires, Département de médecine interne, Institut cardiaque, pulmonaire et vasculaire, Université de Cincinnati, Cincinnati, OH, 45267, États-Unis

Mohit Kumar et Sakthivel Sadayappan

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

LH et MK ont contribué à parts égales à ce travail. LH, MK, SS et GS ont conçu et conçu les expériences. LH, MK, PA, YC, NE et CP ont réalisé les expériences et analysé les données expérimentales. WMS a aidé à synthétiser les peptides. LH et MK ont rédigé le manuscrit. GS et SS ont aidé à écrire, éditer et réviser le manuscrit. Tous les auteurs ont lu le manuscrit.

Correspondance à Gayathri Swaminath.

Sakthivel Sadayappan a fourni des études de consultation et de recherche collaborative à la Fondation Leducq, Pfizer, Novo Nordisk, Amgen, AstraZeneca, MyoKardia, mais ces travaux ne sont pas liés au contenu de ce manuscrit. Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêt avec le contenu de cet article.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui autorise l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur tout support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel de tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Hou, L., Kumar, M., Anand, P. et al. La modulation de la myosine par les peptides de la protéine C de liaison à la myosine cardiaque améliore la contractilité cardiaque dans des modèles expérimentaux d'insuffisance cardiaque ex vivo. Sci Rep 12, 4337 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-08169-1

Télécharger la citation

Reçu : 05 octobre 2021

Accepté : 03 mars 2022

Publié: 14 mars 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-08169-1

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.