Modèle de culture de tissu cardiaque biomimétique (CTCM) pour émuler la physiologie et la physiopathologie cardiaques ex vivo - Visionnaire de ShenyangPeak Ventures Co., Ltd

Communications Biology volume 5, Article number: 934 (2022) Citer cet article

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Il existe un besoin pour un système in vitro fiable qui puisse reproduire avec précision l'environnement physiologique cardiaque pour les tests de dépistage de drogue. La disponibilité limitée des systèmes de culture de tissus cardiaques humains a conduit à des interprétations inexactes des effets des médicaments liés au cœur. Ici, nous avons développé un modèle de culture de tissu cardiaque (CTCM) qui peut stimuler électromécaniquement des tranches de cœur avec des étirements physiologiques en systole et en diastole au cours du cycle cardiaque. Après 12 jours de culture, cette approche a partiellement amélioré la viabilité des tranches de cœur mais n'a pas complètement maintenu leur intégrité structurelle. Par conséquent, après le criblage de petites molécules, nous avons constaté que l'incorporation de 100 nM de tri-iodothyronine (T3) et de 1 μM de dexaméthasone (Dex) dans nos milieux de culture préservait la structure microscopique des tranches pendant 12 jours. Lorsqu'il est combiné avec le traitement T3/Dex, le système CTCM a maintenu le profil transcriptionnel, la viabilité, l'activité métabolique et l'intégrité structurelle pendant 12 jours aux mêmes niveaux que le tissu cardiaque frais. En outre, l'étirement excessif du tissu cardiaque induit une signalisation hypertrophique cardiaque en culture, ce qui fournit une preuve de concept de la capacité du CTCM à imiter les conditions hypertrophiques induites par l'étirement cardiaque. En conclusion, CTCM peut émuler la physiologie cardiaque et la physiopathologie en culture pendant une période prolongée, permettant ainsi un dépistage fiable des médicaments.

Avant les études cliniques, il existe un besoin pour des systèmes in vitro fiables qui pourraient reproduire avec précision l'environnement physiologique du cœur humain. De tels systèmes devraient modéliser les étirements mécaniques, la fréquence cardiaque et les propriétés électrophysiologiques altérés. Les modèles animaux, la plate-forme de dépistage de la physiologie cardiaque couramment utilisée, ont une fiabilité limitée pour refléter les effets des médicaments observés dans le cœur humain1,2. En fin de compte, le modèle de culture de tissu cardiaque expérimental idéal (CTCM) est celui qui démontre une sensibilité et une spécificité élevées pour diverses interventions thérapeutiques et pharmacologiques tout en reproduisant avec précision la physiologie et la physiopathologie du cœur humain3. L'absence d'un tel système a limité la découverte de nouveaux médicaments pour l'insuffisance cardiaque4,5 et a fait de la cardiotoxicité induite par les médicaments une cause majeure de retrait du marché6.

Au cours de la dernière décennie, huit médicaments non cardiovasculaires ont été retirés de l'utilisation clinique parce qu'ils induisaient un allongement de l'intervalle QT, entraînant une arythmie ventriculaire et une mort subite7. Par conséquent, il existe un besoin croissant de stratégies de dépistage précliniques fiables pour évaluer l'efficacité et la toxicité cardiovasculaires. L'évolution récente vers l'utilisation de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPS-CM) dans le dépistage des médicaments et les tests de toxicité a fourni une solution partielle à ce problème ; cependant, la nature immature des hiPS-CM et le manque de complexité multicellulaire du tissu cardiaque sont des limites majeures de cette technologie8. Des efforts récents ont montré que cette limitation peut être partiellement surmontée si les hiPS-CM à un stade précoce, peu après le début des contractions spontanées, sont utilisées pour former des hydrogels de tissu cardiaque et sont soumises à une augmentation progressive de la stimulation électrique au fil du temps9. Cependant, ces microtissus hiPS-CMs n'ont pas les propriétés électrophysiologiques et contractiles matures du myocarde humain adulte. De plus, le tissu cardiaque humain est structurellement plus compliqué, composé d'un mélange hétérogène de divers types de cellules, notamment des cellules endothéliales, des neurones et des fibroblastes stromaux liés par un ensemble particulier de protéines de la matrice extracellulaire10. Cette hétérogénéité de la population de cellules non cardiomyocytes11,12,13 dans le cœur des mammifères adultes est un obstacle majeur dans la modélisation du tissu cardiaque à l'aide de types de cellules individuelles. Ces limitations majeures soulignent l'importance de développer des méthodes de culture de tissu myocardique intact dans des conditions physiologiques et pathologiques9.

Des tranches de cœur humain minces (300 μm) cultivées s'avèrent être un modèle prometteur du myocarde humain intact. Cette technologie donne accès à un système multicellulaire tridimensionnel complet similaire au tissu cardiaque humain. Cependant, avant 2019, l'utilisation des tranches de cœur en culture était limitée par la courte période de viabilité en culture (24 h)14,15,16. Cela est dû à de multiples facteurs, notamment le manque d'étirement mécanique physiologique, l'interface air-liquide et l'utilisation d'un milieu de culture simple qui ne prend pas en charge les exigences du tissu cardiaque. En 2019, plusieurs groupes ont démontré que l'incorporation de facteurs mécaniques dans les systèmes de culture de tissus cardiaques pouvait prolonger la durée de vie de la culture, améliorer l'expression cardiaque et modéliser la pathologie cardiaque. Deux études élégantes17 et 18 ont montré l'influence positive de la charge mécanique uniaxiale sur le phénotype cardiaque pendant la culture. Cependant, ces études n'ont pas utilisé la charge mécanique physiologique tridimensionnelle dynamique du cycle cardiaque puisque les tranches de cœur étaient soit chargées avec des forces d'étirement isométriques17 soit avec une charge auxotonique linéaire18. Ces méthodes d'étirement du tissu ont entraîné la régulation à la baisse de plusieurs gènes cardiaques ou la surexpression de gènes liés à la réponse d'étirement pathologique. Notamment, Pitoulis et al.19 ont développé un bain de culture de tranches cardiaques dynamiques pour recréer le cycle cardiaque à l'aide d'un retour de transducteur de force et d'un actionneur de civière. Alors que ce système permettait de simuler plus précisément le cycle cardiaque in vitro, la complexité et le faible débit de la méthode limitent l'application du système. Notre laboratoire a récemment développé un système de culture simplifié utilisant la stimulation électrique et un milieu de culture optimisé pour maintenir la viabilité des tranches de tissu cardiaque porcin et humain jusqu'à 6 jours20,21.

Dans le manuscrit actuel, à l'aide de tranches de cœur de porc, nous décrivons un modèle de culture de tissu cardiaque (CTCM) qui récapitule les étirements physiologiques et physiopathologiques cardiaques tridimensionnels au cours du cycle cardiaque combinés à des signaux humoraux. Ce CTCM a le potentiel de faire progresser la précision de la prédiction préclinique des médicaments à des niveaux auparavant inatteignables en fournissant un système cardiaque rentable à moyen débit qui imite les étirements physiologiques/pathophysiologiques cardiaques des mammifères pour les tests précliniques de médicaments.

Les signaux mécaniques hémodynamiques jouent un rôle essentiel dans la préservation de la fonctionnalité des cardiomyocytes in vitro22,23,24. Dans le manuscrit actuel, nous avons développé un CTCM (Fig. 1a) qui peut émuler le milieu cardiaque adulte en induisant une stimulation électrique et mécanique simultanée à la fréquence physiologique (1,2 Hz, 72 battements par minute). Pour éviter de trop étirer le tissu pendant la phase diastolique, les tissus ont été surdimensionnés de 25 % à l'aide d'un appareil imprimé en trois dimensions (Fig. 1b). La stimulation électrique induite par un système C-PACE a été synchronisée pour démarrer à 100 ms avant la phase systolique à l'aide d'un système d'acquisition de données pour reproduire entièrement le cycle cardiaque. Le système de culture tissulaire utilise un pilote pneumatique programmable (LB engineering, Allemagne) pour distendre cycliquement une membrane de silicone flexible induisant l'étirement des tranches de cœur dans les chambres ci-dessus. Le système est connecté à une ligne d'air externe avec une sonde de pression permettant un réglage fin de la pression (±1 mmHg) et de la temporisation (± 1 ms) (Fig. 1c).

a Les tranches de tissu sont attachées à des anneaux de support de 7 mm de diamètre représentés en bleu dans la chambre de culture du dispositif. La chambre de culture est séparée de la chambre à air par une fine membrane souple en silicone. Entre chaque chambre, un joint d'étanchéité a été placé pour éviter les fuites. Le couvercle de l'appareil contient des électrodes en graphite qui fournissent une stimulation électrique. b Illustration schématique de l'appareil de surdimensionnement des tissus, du guide annulaire et de l'anneau de support. Des tranches de tissu (marron) sont positionnées sur le dispositif de surdimensionnement et le guide annulaire est placé dans la rainure sur le bord extérieur de l'appareil. À l'aide du guide, l'anneau de support enduit de colle histoacryl est soigneusement placé sur la tranche de tissu cardiaque. c Un diagramme illustrant le moment de la stimulation électrique par rapport à la pression dans la chambre à air contrôlée par le pilote pneumatique programmable (PPD). Un dispositif d'acquisition de données a été utilisé pour synchroniser la stimulation électrique à l'aide d'un capteur de sonde de pression. Lorsque la pression dans la chambre de culture atteint un seuil spécifié, un signal d'impulsion est envoyé au dispositif C-PACE-EM pour induire une stimulation électrique. d Image de quatre dispositifs CTCM installés sur une étagère d'un incubateur. Ces quatre appareils sont connectés à un seul PPD par les compagnies aériennes, et un capteur de pression est inséré dans une valve hémostatique pour surveiller la pression dans la compagnie aérienne. Chaque appareil peut accueillir six tranches de tissu.

À l'aide d'un pilote pneumatique, nous pouvons faire fonctionner 4 appareils CTCM, chacun pouvant accueillir 6 tranches de tissu (Fig. 1d). Dans le CTCM, les pressions d'air dans les chambres à air sont traduites en pressions synchronisées dans la chambre à fluide et produisent un étirement physiologique des tranches cardiaques (Fig. 2a et Film supplémentaire 1). L'évaluation de l'étirement tissulaire à 80 mmHg a entraîné un étirement de 25 % de la tranche de tissu (Fig. 2b). Il a été démontré que ce pourcentage d'étirement correspond à une longueur de sarcomère physiologique, de 2,2 à 2,3 μm, pour une contractilité normale des tranches de cœur17,19,25. Les mouvements des tissus sont évalués à l'aide d'une configuration de caméra personnalisée (Fig. 1 supplémentaire). L'amplitude du mouvement des tissus et la vitesse (Fig. 2c, d) sont compatibles avec l'étirement pendant le cycle cardiaque et le moment pendant la systole et la diastole (Fig. 2b). L'étirement et la vitesse du tissu cardiaque pendant la contraction et la relaxation sont restés constants au cours des 12 jours de culture (Fig. 2e). Pour évaluer l'effet de la stimulation électrique sur la contractilité pendant la culture, nous avons développé une méthode pour déterminer la souche vivante à l'aide de l'algorithme Shape from Shading (Fig. 2a, b supplémentaire) et avons pu différencier la souche avec et sans stimulation électrique des mêmes tranches de cœur (Fig. 2f). La contrainte avec stimulation électrique est 20 % plus élevée que sans stimulation électrique dans les régions mobiles des tranches (R6-9), ce qui indique la contribution de la stimulation électrique à la fonction contractile.

a Des traces représentatives de la pression de la chambre à air, de la pression de la chambre à fluide et des mesures de mouvement des tissus ont vérifié que la pression de la chambre à air modifie la pression de la chambre à fluide, ce qui induit un mouvement de tranche de tissu correspondant. b Des traces représentatives du pourcentage d'étirement (bleu) des tranches de tissu correspondent au pourcentage d'étirement (orange). c Le mouvement de la tranche cardiaque mesuré était cohérent avec la vitesse de mouvement mesurée. (d) Trace représentative des mouvements du cycle des tranches cardiaques (ligne bleue) et de la vitesse (ligne orange pointillée). e Quantification du temps de cycle (n = 19 tranches/groupe de différents porcs), temps de contraction (n = 19 tranches/groupe), temps de relaxation (n = 19 tranches/groupe de différents porcs), mouvement des tissus (n = 25 tranches/groupe de différents porcs), vitesse de contraction maximale (n = 24 (J0), 25 (J12) tranches/groupe de différents porcs) ; et les vitesses de relaxation maximales (n = 24(D0), 25 (D12) tranches/groupe de porcs différents). Les tests t de Student bilatéraux n'ont révélé aucune différence significative dans aucun des paramètres. f Trace représentative pour l'analyse de la souche d'une tranche de tissu avec (rouge) et sans (bleu) stimulation électrique sur dix zones régionales de la tranche de tissu de la même tranche. Le panneau inférieur montre la quantification de la différence de pourcentage dans la souche des tranches de tissu avec et sans stimulation électrique sur dix zones régionales à partir de tranches différentes. (n = 8 tranches/groupe de porcs différents, un test t de Student bilatéral est effectué ; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). Les barres d'erreur sont représentatives de la moyenne ± SD.

Dans notre précédent système de culture de tranches de cœur biomimétique statique, nous avons maintenu la viabilité, la fonctionnalité et l'intégrité structurelle des tranches de cœur pendant 6 jours avec l'application d'une stimulation électrique et une composition optimisée du milieu de culture. Cependant, après 10 jours, il y avait une forte baisse de ces paramètres. Nous nous référerons aux tranches cultivées dans notre système de culture biomimétique statique précédent comme condition de contrôle (Ctrl), et nous nous référerons aux tranches cultivées sous stimulation mécanique et électrique synchronisée (CTCM) en utilisant nos milieux de culture précédemment optimisés comme condition MC. Premièrement, nous avons déterminé que la stimulation mécanique sans stimulation électrique est insuffisante pour maintenir la viabilité des tissus pendant 6 jours (Fig. 3a, b supplémentaires). Fait intéressant, en introduisant à la fois des stimulations physiologiques mécaniques et électriques à l'aide du CTCM, la viabilité des tranches de cœur de 12 jours a été maintenue similaire à celle des tranches de cœur fraîches dans l'état MC mais pas dans l'état Ctrl, comme le montre le test MTT (Fig. 3a). Cela indique que la stimulation mécanique et la simulation du cycle cardiaque peuvent maintenir la viabilité des tranches de tissu pendant deux fois le temps rapporté dans notre système de culture statique précédent. Cependant, l'évaluation de l'intégrité structurelle des tranches de tissu par immunomarquage pour la troponine-T cardiaque et la connexine 43 a démontré que l'expression de la connexine 43 du tissu MC au jour 12 était significativement plus élevée que le témoin le même jour. Pourtant, l'expression uniforme de la connexine43 et la formation du disque Z n'étaient pas entièrement maintenues (Fig. 3b). Nous avons utilisé un cadre basé sur l'intelligence artificielle (IA) pour quantifier l'intégrité structurelle des tissus26, basé sur un pipeline d'apprentissage en profondeur basé sur l'image pour la quantification automatisée de l'intégrité structurelle des tranches de cœur basée sur la coloration de la troponine-T et de la Connexine 43 en termes de localisation et d'intensité fluorescente. Cette technique utilise un réseau neuronal convolutif (CNN) et le cadre d'apprentissage en profondeur pour quantifier de manière fiable l'intégrité structurelle du tissu cardiaque de manière automatisée et impartiale, comme décrit dans la réf. 26. Le tissu MC a montré une similarité structurelle améliorée au jour 0 par rapport aux tranches de contrôle statiques. De plus, la coloration au trichrome de Masson a montré un pourcentage de surface de fibrose significativement inférieur avec la condition MC par rapport à la condition témoin au jour 12 de la culture (Fig. 3c). Bien que le CTCM ait amélioré la viabilité des tranches de tissu cardiaque du jour 12 à des niveaux similaires à ceux du tissu cardiaque frais, il n'a pas amélioré de manière significative l'intégrité structurelle des tranches de cœur.

un graphique à barres montre la quantification de la viabilité MTT de tranches de cœur frais (J0) ou de tranches de cœur en culture pendant 12 jours soit en culture statique (J12 Ctrl) soit en CTCM (J12 MC) (n = 18 (J0), 15 (J12 Ctrl), 12 (J12 MC) tranches/groupe de différents porcs, un test ANOVA à une voie est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à J0 et **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl). b Images d'immunofluorescence représentatives pour la troponine-T (vert), la connexine 43 (rouge) et le DAPI (bleu) pour des tranches de cœur fraîchement isolées (D0) ou des tranches de cœur cultivées pendant 12 jours dans des conditions statiques (Ctrl) ou des conditions CTCM (MC) (Échelle nue = 100 µm). Quantification par intelligence artificielle de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranches/groupe chacune provenant de porcs différents, un test ANOVA unidirectionnel est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). c Images représentatives (à gauche) et quantification (à droite) pour les tranches de cœur colorées avec la tache trichrome de Masson (échelle nue = 500 µm) (n = 10 tranches/groupe chacune provenant de porcs différents, un test ANOVA unidirectionnel est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). Les barres d'erreur sont représentatives de la moyenne ± SD.

Nous avons émis l'hypothèse qu'en incorporant de petites molécules dans les milieux de culture, l'intégrité des cardiomyocytes pourrait être améliorée et le développement de la fibrose au cours de la culture CTCM pourrait être réduit. Par conséquent, nous avons effectué un criblage de petites molécules en utilisant notre culture témoin statique20,21 en raison du nombre inférieur de facteurs de confusion qui lui sont associés. La dexaméthasone (Dex), la tri-iodothyronine (T3) et le SB431542 (SB) ont été sélectionnés pour ce dépistage. Ces petites molécules ont déjà été utilisées dans des cultures hiPSC-CM pour induire la maturation des cardiomyocytes en améliorant la longueur du sarcomère, les tubules en T et la vitesse de conduction27,28. De plus, le Dex, un glucocorticoïde, et le SB sont connus pour supprimer l'inflammation29,30. Par conséquent, nous avons testé si l'incorporation d'une ou d'une combinaison de ces petites molécules améliorerait l'intégrité structurelle des tranches de cœur. Pour le criblage initial, le dosage de chaque composé a été sélectionné en fonction de la concentration généralement utilisée dans les modèles de culture cellulaire (1 μM Dex27, 100 nM T327 et 2,5 μM SB31). Après 12 jours de culture, la combinaison de T3 et de Dex a entraîné la meilleure intégrité structurelle des cardiomyocytes et le plus faible remodelage fibrotique (Figs. 4 et 5 supplémentaires). De plus, l'utilisation de la moitié ou du double de ces concentrations de T3 et de Dex a eu des effets néfastes par rapport aux concentrations normales (Fig. 6a, b supplémentaires).

Après le dépistage initial, nous avons effectué des comparaisons directes de 4 conditions de culture (Fig. 4a); Ctrl : tranches de cœur cultivées dans notre culture statique décrite précédemment avec nos milieux de culture optimisés ; 20,21 TD : Ctrl avec T3 et Dex ajoutés aux milieux de culture ; MC : tranches de cœur cultivées en CTCM à l'aide de nos milieux de culture préalablement optimisés ; et MT : CTCM avec T3 et Dex ajoutés au milieu de culture. Après 12 jours de culture, la viabilité des tissus MC et MT a été maintenue similaire à celle des tissus frais, telle qu'évaluée par le test MTT (Fig. 4b). Fait intéressant, l'ajout de T3 et de Dex à la culture transwell (TD) n'a pas amélioré de manière significative la viabilité par rapport à la condition Ctrl, ce qui implique le rôle vital de la stimulation mécanique dans le maintien de la viabilité des tranches cardiaques.

a Représentation schématique de la conception expérimentale illustrant les quatre conditions de culture qui ont été utilisées pour évaluer l'effet de la combinaison de la stimulation mécanique et de l'ajout de T3/Dex au milieu de culture au cours de 12 jours. b Le graphique à barres montre la quantification de la viabilité 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (Ctrl, TD, MC et MT) par rapport aux tranches de cœur frais (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), 12 (D12 MC) tranches/groupe de différents porcs, un test ANOVA à une voie est effectué ; ####p < 0,0001, ### p < 0,001 par rapport à D0 et **p < 0,01 par rapport à D12 Ctrl). c Le graphique à barres montre la quantification du flux de glucose 12 jours après la culture dans les 4 conditions de culture (Ctrl, TD, MC et MT) par rapport aux tranches de cœur frais (D0) (n = 6 tranches/groupe de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ###p < 0,001, par rapport à D0 et ***p < 0,001 par rapport à D12 Ctrl). d Parcelle d'analyse de la souche pour les tissus frais (bleu), 12 MC (vert) et 12 MT (rouge) sur les dix points régionaux de la tranche de tissu (n = 4 tranches/groupe, un test ANOVA à sens unique est effectué ; aucune différence significative entre les groupes). e Parcelles volcaniques montrant les gènes différentiellement exprimés dans des tranches de cœur fraîches (D0) par rapport à des tranches de cœur cultivées dans des conditions statiques (Ctrl) ou des conditions MT (MT) pendant 10 à 12 jours. f Heatmap pour les gènes sarcomériques pour les tranches de cœur cultivées dans chaque condition de culture. Les barres d'erreur sont représentatives de la moyenne ± SD.

Un changement dans la dépendance métabolique de l'oxydation des acides gras à la glycolyse est une caractéristique de la dédifférenciation des cardiomyocytes. Les cardiomyocytes immatures utilisent principalement le glucose pour la production d'ATP et ont des mitochondries sous-développées avec peu de crêtes 5,32. Le test d'utilisation du glucose a démontré que dans les conditions MC et MT, l'utilisation du glucose était similaire au tissu du jour 0 (Fig. 4c). Cependant, les échantillons Ctrl ont montré une augmentation significative de l'utilisation du glucose par rapport aux tissus frais. Cela indique que la combinaison CTCM et T3/Dex améliore la viabilité des tissus et préserve le phénotype métabolique des tranches de cœur cultivées pendant 12 jours. De plus, l'analyse de la souche a montré le maintien des niveaux de souche dans les conditions MT et MC similaires au tissu cardiaque frais pendant 12 jours (Fig. 4d).

Pour analyser l'impact global du CTCM et du T3/Dex sur le paysage transcriptionnel global du tissu des tranches cardiaques, nous avons effectué un RNAseq sur des tranches cardiaques provenant des quatre conditions de culture différentes (Données supplémentaires 1). Fait intéressant, les tranches de MT ont montré une similitude transcriptionnelle élevée avec le tissu cardiaque frais, avec seulement 16 gènes sur 13 642 exprimés de manière différentielle. Cependant, comme nous l'avons démontré auparavant21, les tranches Ctrl montraient 1229 gènes exprimés de manière différentielle après 10 à 12 jours de culture (Fig. 4e). Ces données ont été validées par qRT-PCR des gènes cardiaques et fibroblastiques (Fig. 7a – c supplémentaires). Fait intéressant, les tranches Ctrl ont montré une régulation à la baisse des gènes cardiaques et du cycle cellulaire et une régulation à la hausse des programmes de gènes inflammatoires. Ces données indiquent que la dédifférenciation qui se produit normalement après une culture à long terme a été complètement atténuée dans la condition MT (Fig. 8a, b supplémentaires). Un examen plus approfondi des gènes sarcomériques a révélé que seules les conditions MT préservaient les gènes codant pour les canaux sarcomériques (Fig. 4f) et ioniques (Fig. 9 supplémentaire) de la régulation négative observée dans les conditions Ctrl, TD et MC. Ces données indiquent qu'avec la combinaison de la stimulation mécanique et humorale (T3/Dex), le transcriptome des tranches cardiaques pourrait être maintenu similaire aux tranches cardiaques fraîches pendant 12 jours en culture.

Ces découvertes transcriptionnelles ont été confirmées par le fait que l'intégrité structurelle des cardiomyocytes dans les tranches de cœur était mieux préservée pendant 12 jours dans l'état MT, comme le montre la protéine de jonction lacunaire intacte et localisée, la connexine 43 (Fig. 5a). De plus, la fibrose dans les tranches de cœur en condition MT était significativement réduite par rapport à Ctrl et était similaire aux tranches de cœur fraîches (Fig. 5b). Ces données indiquent que la combinaison de la stimulation mécanique et du traitement T3/Dex a efficacement préservé la structure cardiaque de la tranche cardiaque pendant une période prolongée en culture.

a Images d'immunofluorescence représentatives pour la troponine-T (vert), la connexine 43 (rouge) et le DAPI (bleu) pour les tranches de cœur fraîchement isolées (D0) ou les tranches de cœur cultivées pendant 12 jours dans les quatre conditions de culture (barre d'échelle = 100 µm). Quantification par intelligence artificielle de l'intégrité structurelle du tissu cardiaque (n = 7 (J0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) tranches/groupe de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à J0 et *p < 0,05, ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). b Images représentatives et quantification des tranches de cœur colorées au trichrome de Masson (barre d'échelle = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) tranches/groupe de porcs différents, un test ANOVA à un facteur est effectué ; ####p < 0,0001 par rapport à D0 et ***p < 0,001, ou ****p < 0,0001 par rapport à D12 Ctrl). Les barres d'erreur sont représentatives de la moyenne ± SD.

Enfin, la capacité du CTCM à modéliser l'hypertrophie cardiaque a été évaluée en augmentant l'amplitude d'étirement du tissu cardiaque. Dans le CTCM, la pression maximale dans la chambre à air a été augmentée de 80 mmHg (étirement normal) à 140 mmHg (Fig. 6a). Cela correspond à une augmentation de l'étirement de 32 % (Fig. 6b), ce qui s'est déjà avéré être le pourcentage d'étirement approprié nécessaire pour qu'une tranche de cœur atteigne une longueur de sarcomère similaire à celle observée dans l'hypertrophie17,19,25. L'étirement et la vitesse du tissu cardiaque pendant la contraction et la relaxation sont restés constants au cours des six jours de culture (Fig. 6c). Les tranches de tissu cardiaque provenant des conditions MT ont été soit soumises à des conditions d'étirement normal (MT (Norm)) soit à des conditions d'étirement excessif (MT (OS)) pendant six jours. Dès quatre jours de culture, le biomarqueur hypertrophique, NT-ProBNP, était significativement augmenté dans le milieu de culture dans les conditions MT (OS) par rapport aux conditions MT (Norm) (Fig. 7a). De plus, après six jours de culture, la taille des cellules dans MT (OS) (Fig. 7b) a été significativement augmentée par rapport aux tranches de cœur MT (Norm). De plus, la translocation nucléaire de NFATC4 était significativement augmentée dans les tissus sur-étirés (Fig. 7c). Ces résultats montrent le développement progressif du remodelage pathologique suite à un étirement excessif et fournissent une preuve de concept que le dispositif CTCM peut être utilisé comme plate-forme pour étudier la signalisation de l'hypertrophie cardiaque induite par l'étirement.

a Quantification par graphique à barres de la concentration de NT-ProBNP dans les milieux de culture à partir de tranches de cœur cultivées dans des conditions d'étirement normal MT (Norm) ou de surétirement (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm et D4 MTOS) tranches/groupe de différents porcs, une ANOVA à deux voies est effectuée ; ** p < 0,01 par rapport à l'étirement normal). b Images représentatives pour les tranches de cœur colorées avec la troponine-T et WGA (à gauche) et la quantification de la taille des cellules (à droite) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellules/groupe de 10 tranches différentes de différents porcs, un test t de Student à deux queues est effectué ; ****p < 0,0001 par rapport à l'étirement normal). c Images représentatives pour les tranches de cœur MTOS des jours 0 et 6 immunomarquées pour la troponine-T et NFATC4 et quantification de la translocation de NFATC4 vers les noyaux des CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranches/groupe de porcs différents, un test t de Student à deux queues est effectué ; *p < 0,05). Les barres d'erreur sont représentatives de la moyenne ± SD.

La recherche cardiovasculaire translationnelle nécessite des modèles cellulaires capables de répliquer fidèlement le milieu cardiaque. Dans cette étude, un dispositif CTCM capable de stimuler des tranches cardiaques ultra-fines a été développé et caractérisé. Le système CTCM englobe la stimulation électromécanique synchronisée physiologique couplée à un enrichissement humoral avec T3 et Dex. En soumettant des tranches de cœur de porc à ces facteurs, la viabilité, l'intégrité structurelle, l'activité métabolique et l'expression transcriptionnelle ont toutes été maintenues similaires au tissu cardiaque frais pendant 12 jours en culture. De plus, un étirement excessif du tissu cardiaque provoque une hypertrophie cardiaque induite par un étirement excessif. Dans l'ensemble, ces résultats confirment le rôle critique des conditions de culture physiologiques dans le maintien d'un phénotype cardiaque normal et fournissent une plate-forme pour le dépistage des médicaments.

Plusieurs facteurs contribuent à l'environnement optimal pour la fonction et la survie des cardiomyocytes. Les plus évidents de ces facteurs sont liés à (1) les interactions cellule à cellule, (2) la stimulation électromécanique, (3) les facteurs humoraux et (4) les substrats métaboliques. L'interaction physiologique de cellule à cellule nécessite la présence de réseaux tridimensionnels complexes de type multicellulaire soutenus par une matrice extracellulaire. Cette interaction complexe de cellules est difficile à recréer in vitro grâce à la co-culture de types de cellules individuelles, mais peut être facilement réalisée en utilisant la nature organotypique des tranches de cœur.

L'étirement mécanique et la stimulation électrique des cardiomyocytes sont essentiels pour préserver le phénotype cardiaque33,34,35. Alors que la stimulation mécanique a été largement utilisée dans le conditionnement et la maturation du hiPSC-CM, certaines études élégantes ont récemment tenté de stimuler mécaniquement des tranches de cœur en culture en utilisant une charge uniaxiale17,18,19. Ces études ont montré l'influence positive de la charge mécanique uniaxiale 2D sur le phénotype cardiaque lors de la culture. Dans ces études, les tranches de cœur ont été soit chargées avec des forces d'étirement isométriques17, une charge auxotonique linéaire18, soit recréées le cycle cardiaque à l'aide d'un retour de transducteur de force et d'un actionneur de civière19. Cependant, ces méthodes ont adopté l'étirement uniaxial du tissu sans optimiser les conditions du milieu de culture, ce qui a entraîné la régulation à la baisse de plusieurs gènes cardiaques ou la surexpression de gènes liés à la réponse d'étirement pathologique. Le CTCM décrit ici fournit une stimulation électromécanique tridimensionnelle qui imite le cycle cardiaque natif en termes de synchronisation de cycle et d'étirements physiologiques (étirement de 25 %, systole de 40 %, diastole de 60 % et 72 battements par minute). Alors que cette stimulation mécanique tridimensionnelle seule n'était pas suffisante pour maintenir l'intégrité des tissus, une combinaison de stimulation humorale utilisant T3/Dex avec une stimulation mécanique était nécessaire pour maintenir pleinement la viabilité, la fonctionnalité et l'intégrité des tissus.

Les facteurs humoraux jouent un rôle essentiel dans la régulation du phénotype cardiaque adulte. Cela a été souligné dans les études hiPS-CM qui incorporent T3 et Dex dans le milieu de culture pour favoriser la maturation des cellules. La T3 peut influencer le transport des acides aminés, des sucres et du calcium à travers la membrane cellulaire36. De plus, T3 favorise l'expression de MHC-α et la régulation à la baisse de MHC-β, favorisant les myofibrilles à contraction rapide observées dans les cardiomyocytes matures par rapport aux myofibrilles à contraction lente observées dans les CM fœtales37. L'absence de T3 chez les patients hypothyroïdiens peut entraîner la perte de stries myofibrillaires et un taux réduit de développement de la tension37. Dex agit sur le récepteur des glucocorticoïdes et il a été démontré qu'il augmente la contractilité cardiaque dans les cœurs perfusés ex vivo;38 on pense qu'une amélioration est liée aux effets sur l'entrée de calcium stockée (SOCE)39,40. De plus, Dex se lie à son récepteur ; il induit un large éventail de réponses intracellulaires qui suppriment la fonction immunitaire et l'inflammation30.

Nos résultats démontrent que la stimulation mécanique physiologique (MC) a amélioré les performances globales de la culture par rapport à Ctrl mais ne peut pas maintenir la viabilité, l'intégrité structurelle et l'expression cardiaque pendant 12 jours en culture. L'incorporation du traitement T3 et Dex dans la culture CTCM (MT) a entraîné une viabilité améliorée par rapport à Ctrl et a maintenu le profil transcriptionnel, l'intégrité structurelle et l'activité métabolique similaire au tissu cardiaque frais pendant 12 jours. En outre, un modèle de modélisation de l'hypertrophie cardiaque induite par l'étirement excessif à l'aide du CTCM a été réalisé en contrôlant l'étendue de l'étirement des tissus, illustrant la polyvalence du système CTCM. Il convient de noter que même si le remodelage cardiaque et la fibrose impliquent généralement un organe intact avec des contributions de cellules circulantes qui peuvent fournir des cytokines pertinentes ainsi que la phagocytose et d'autres facteurs de remodelage, les tranches de cœur peuvent encore imiter le processus fibrotique en réponse au stress et aux blessures en différenciant le fibroblaste résident en myofibroblastes. Cela a déjà été évalué dans ce modèle de tranche de cœur15. Il convient de noter que les paramètres CTCM peuvent être modulés pour simuler de nombreuses conditions telles que la tachycardie, la bradycardie et l'assistance circulatoire mécanique (cœur déchargé mécaniquement) en modifiant les amplitudes et fréquences de pression/électriques. Cela permet au système d'être une plate-forme à moyen débit pour le dépistage des drogues. La capacité du CTCM à modéliser l'hypertrophie cardiaque induite par un étirement excessif ouvre la voie à l'utilisation de ce système dans des tests de thérapie personnalisés. En conclusion, la présente étude démontre que les étirements mécaniques et la stimulation humorale sont essentiels pour maintenir les tranches de tissu cardiaque en culture.

Alors que les données présentées ici indiquent que le CTCM est une plate-forme très prometteuse pour la modélisation du myocarde intact, il existe quelques limites à cette méthode de culture. La principale limitation de la culture CTCM est qu'elle applique une charge mécanique dynamique continue aux tranches, ce qui empêche la capacité de surveiller activement la contraction de la tranche cardiaque au cours de chaque cycle. De plus, en raison de la petite taille des tranches de cœur (7 mm), il existe une capacité limitée à effectuer une évaluation de la fonction contractile en dehors du système de culture à l'aide de transducteurs de force traditionnels. Dans le manuscrit actuel, nous surmontons partiellement cette limitation grâce à l'évaluation de la souche optique en tant que lecture de la fonction contractile ; Cependant, cette limitation nécessitera des travaux supplémentaires et pourrait être résolue à l'avenir en mettant en œuvre des méthodes pour surveiller optiquement la fonctionnalité des tranches de cœur dans la culture, comme la cartographie optique à l'aide de colorants sensibles au calcium et à la tension. Une autre limitation du CTCM est que le modèle de travail ne manipule pas les pressions physiologiques (précharge et postcharge). Dans le CTCM, la pression est induite dans des directions opposées pour reproduire les étirements physiologiques pendant la diastole (étirement complet) et la systole (longueur contractée lors de la stimulation électrique) dans un tissu surdimensionné de 25 %. Cette limitation devrait être abordée dans la future conception CTCM en pressurisant complètement le tissu cardiaque des deux côtés et en appliquant la relation pression-volume précise qui se produit dans les cavités cardiaques.

Le remodelage induit par l'étirement excessif rapporté dans ce manuscrit est limité à l'émulation uniquement de la signalisation hypertrophique d'étirement excessif. Par conséquent, ce modèle pourrait aider à étudier la signalisation hypertrophique induite par l'étirement41,42 sans facteurs humoraux ou neuronaux (qui manquent dans ce système). D'autres études sont nécessaires pour ajouter de la multiplexité au CTCM, telles que la co-culture avec des cellules immunitaires, les facteurs plasmatiques humoraux circulants et l'innervation avec la co-culture de cellules neuronales feraient progresser la capacité de modélisation de la maladie du CTCM.

Treize porcs ont été utilisés dans la présente étude. Toutes les procédures animales étaient conformes aux directives institutionnelles et approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Louisville. L'arc aortique a été clampé et les cœurs ont été perfusés avec 1 L de solution de cardioplégie stérile (NaCl 110 mM, CaCl2 1,2 mM, KCl 16 mM, MgCl2 16 mM, NaHCO3 10 mM, 5 unités/ml d'héparine, pH à 7,4) ; les cœurs ont été conservés dans une solution cardioplégique glacée jusqu'à ce qu'ils soient transportés au laboratoire sur de la glace, ce qui est généralement <10 min.

Les dispositifs CTCM ont été conçus dans le logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) SolidWorks. La chambre de culture, la plaque de séparation et la chambre à air ont été fabriquées à l'aide d'un usinage CNC (commande numérique par ordinateur) en plastique acrylique transparent. Les anneaux de support de 7 mm ont été centrés à partir de plastique polyéthylène haute densité (PEHD) et équipés d'une rainure de joint torique pour accueillir des joints toriques en silicone pour sceller le support en dessous. Une fine membrane en silicone sépare la chambre de culture de la plaque de séparation. La membrane en silicone a été découpée au laser dans une feuille de silicone de 0,02'', duromètre 35 A. Les joints en silicone inférieur et supérieur ont été découpés au laser dans une feuille de silicone de 1/16'', duromètre 50 A. Des vis en acier inoxydable 316 L et des écrous à oreilles ont été utilisés pour maintenir l'appareil ensemble afin de créer un joint étanche à l'air.

Une carte de circuit imprimé (PCB) personnalisée a été conçue pour s'intégrer au système C-PACE-EM. Les prises des en-têtes de machine suisses sur le PCB sont connectées à une électrode en graphite via des fils de cuivre plaqués argent et des vis en bronze 0-60 vissées dans les électrodes. Le PCB s'insère dans un couvercle d'appareil imprimé en trois dimensions.

Le dispositif CTCM est contrôlé par un pilote pneumatique programmable (PPD) qui peut induire une pression cyclique contrôlée similaire au cycle cardiaque. Au fur et à mesure que la pression dans la chambre à air augmente, la membrane de silicone flexible se distendra vers le haut, déplaçant le milieu de culture sous les tranches de tissu. Les tranches de tissu seront ensuite étirées par ce déplacement de fluide, imitant l'étirement cardiaque physiologique pendant la diastole. Au sommet de cette diastole, une stimulation électrique est appliquée à travers les électrodes en graphite et la pression de la chambre à air est diminuée, permettant aux tranches de tissu de se contracter. Dans la compagnie aérienne, il y a une valve hémostatique avec un capteur de sonde de pression qui détecte la pression du système d'air. La pression détectée par le capteur de pression est introduite dans un dispositif d'acquisition de données connecté à un ordinateur portable. Cela permet une surveillance continue des pressions à l'intérieur de la chambre à air. Lorsque la pression maximale de la chambre à air (80 mmHg pour la norme et 140 mmHg pour l'OS) est atteinte, le dispositif d'acquisition de données est invité à envoyer un signal au système C-PACE-EM induisant un signal de tension électrique biphasique de 2 ms réglé sur 4 V.

Des tranches de cœur ont été obtenues et les conditions de culture à 6 puits ont été réalisées comme décrit ci-dessous : le cœur collecté est transféré du récipient de transfert vers un plateau contenant une solution cardioplégique froide (4 °C). Le ventricule gauche est isolé à l'aide de lames stériles et découpé en blocs de 1 à 2 cm3. Ces blocs de tissus sont attachés à des supports de tissus à l'aide de colle tissulaire et placés dans le bain de tissus d'un microtome vibrant contenant la solution de Tyrode avec oxygénation continue (3 g/L 2,3-butanedione monoxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM Mg Cl2 (1 mL de solution 1 M), CaCl2 1,8 mM (1,8 mL de solution 1 M), jusqu'à 1 L de ddH2O). Le microtome vibrant est réglé pour couper des tranches de 300 μm à une fréquence de 80 Hz, une amplitude de vibration horizontale de 2 mm et une vitesse d'avance de 0,03 mm/s. Le bain de tissu est entouré de glace pour maintenir une solution réfrigérée et maintenir la température à 4 ° C. Les tranches de tissu sont transférées d'un bain de microtome à un bain de maintien contenant une solution de Tyrode oxygénée en continu sur de la glace jusqu'à ce que suffisamment de tranches soient obtenues pour une plaque de culture. Pour les conditions de culture transwell, les tranches de tissu sont collées sur des supports en polyuréthane stérilisé de 6 mm de large et placées dans des plaques de culture à six puits contenant 6 ml de milieu de culture optimisé (Medium 199, 1x supplément ITS, 10 % FBS, 5 ng/mL VEGF, 10 ng/mL FGF-basic et 2X Antibiotic-Antimycotic). Une stimulation électrique (10 V, stimulée à 1,2 Hz) a été appliquée aux tranches de tissu à travers les couvercles C-Pace. Pour les conditions TD, du T3 et du Dex frais ont été ajoutés à des concentrations de 100 nM et 1 μM à chaque changement de support. Le milieu de culture est oxygéné avant chaque changement de milieu trois fois par jour. Les tranches de tissu ont été cultivées dans un incubateur réglé à 37 ° C avec 5% de CO2.

Pour la culture CTCM, les tranches de tissu ont été positionnées sur un appareil personnalisé imprimé en trois dimensions dans une boîte de Pétri contenant une solution de Tyrode modifiée. Le dispositif est conçu pour surdimensionner la tranche cardiaque de 25 % de la surface de l'anneau de support. Ceci est fait pour s'assurer que la tranche de coeur n'est pas trop étirée une fois qu'elle a été transférée de la solution de Tyrode aux milieux de culture et pendant la phase diastolique. A l'aide de colle histoacryl, les tranches de 300 μm d'épaisseur ont été fixées sur des anneaux de support de 7 mm de diamètre. Une fois que la tranche de tissu a été attachée à l'anneau de support, la tranche de tissu en excès a été coupée et la tranche de tissu attachée a été replacée dans le bain de solution de Tyrode sur glace (4 ° C) jusqu'à ce que suffisamment de tranches aient été préparées pour un appareil. Le temps de traitement ne doit pas dépasser 2 h au total pour tous les appareils. Une fois que 6 tranches de tissu ont été attachées à leurs anneaux de support, le dispositif CTCM a été assemblé. La chambre de culture CTCM a été pré-remplie avec 21 ml de milieu de culture pré-oxygéné. Les tranches de tissu ont été transférées dans la chambre de culture et toutes les bulles d'air ont été soigneusement éliminées avec une pipette. Ensuite, la tranche de tissu a été guidée vers un puits et doucement pressée en place. Enfin, le couvercle de l'électrode a été placé sur l'appareil et l'appareil a été transféré dans un incubateur. Le CTCM a ensuite été connecté aux tubes d'air et au système C-PACE-EM. Le pilote pneumatique a été mis en marche et la vanne de débit d'air s'est ouverte vers le dispositif CTCM. Le système C-PACE-EM a été réglé pour fournir 4 V à 1,2 Hz à une stimulation biphasique de 2 ms. Le milieu de culture a été changé deux fois par jour et les électrodes ont été remplacées une fois par jour pour éviter l'accumulation de graphite à partir des électrodes. Si nécessaire, les tranches de tissu peuvent être retirées de leurs puits de culture pour déplacer les bulles d'air qui peuvent être piégées ci-dessous. Pour les conditions MT, le traitement T3/Dex a été ajouté frais à chaque changement de support à 100 nM T3 et 1 μM Dex. Les dispositifs CTCM ont été cultivés dans un incubateur réglé à 37°C avec 5% de CO2.

Un système de caméra personnalisé a été développé pour obtenir une trace d'étirement des tranches de cœur. Un appareil photo reflex numérique (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japon) a été utilisé avec un objectif macro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA). Après avoir changé le support avec un milieu de culture frais, l'imagerie a été réalisée à température ambiante. La caméra a été placée à un angle de 51° et les vidéos ont été enregistrées à 30 ips. Tout d'abord, un logiciel open-source (MUSCLEMOTION43) a été utilisé avec Image-J pour quantifier le mouvement des tranches de cœur. Un masque a été créé à l'aide de MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) pour définir la région d'intérêt de la tranche de cœur battant afin d'éviter tout bruit. Le masque segmenté manuellement a été appliqué à toutes les images de la séquence d'images, puis transmis au plug-in MUSCLEMOTION. Le mouvement MUSCLE utilise l'intensité moyenne des pixels dans chaque image pour quantifier son mouvement par rapport à une image de référence. Les données ont été enregistrées, filtrées et utilisées pour quantifier le temps de cycle et évaluer les étirements tissulaires pendant le cycle cardiaque. Le post-traitement des vidéos enregistrées a été effectué à l'aide d'un filtre numérique de premier ordre à phase zéro. Pour quantifier l'étirement des tissus (crête à crête), une analyse de crête a été effectuée pour distinguer les crêtes et les vallées du signal enregistré. De plus, une suppression de tendance a été effectuée pour éliminer la dérive du signal à l'aide d'un polynôme du 6ème ordre. Le code logiciel a été développé dans MATLAB pour détecter le mouvement global des tissus, le temps de cycle, le temps de relaxation et le temps de contraction (code logiciel supplémentaire44).

Pour l'analyse de déformation, en utilisant les mêmes vidéos générées pour l'évaluation de l'étirement mécanique, nous avons d'abord suivi les deux images qui représentent les pics des mouvements (point le plus haut du mouvement (Haut) et point le plus bas (Bas)) selon le logiciel MUSCLEMOTION. Ensuite, nous avons segmenté les zones tissulaires et appliqué la forme de l'algorithme d'ombrage45 sur les tissus segmentés (Fig. 2a supplémentaire). Le tissu segmenté est ensuite divisé en dix sous-surfaces et la déformation de chaque surface est calculée à l'aide de l'équation suivante : Strain = (Sup−Sdown)/Sdown où Sup et Sdown sont les distances de la forme à partir de l'ombrage des tissus haut et bas, respectivement (Fig. 2b supplémentaire).

Les tranches de cœur ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 48 h. Le tissu fixé a subi une déshydratation dans 10% puis 20% de saccharose pendant 1 h, suivi de 30% de saccharose pendant la nuit. Les tranches ont ensuite été enrobées dans un composé à température de coupe optimale (composé OCT) et progressivement congelées dans un bain d'isopentane/glace carbonique. Les blocs intégrés OCT ont été stockés à -80 ° C jusqu'à la coupe. Les lames ont été préparées en coupes de 8 µm d'épaisseur.

Pour retirer l'OCT des tranches de cœur, les lames ont été chauffées sur un bloc chauffant pendant 5 min à 95 ° C. 1 ml de PBS a été ajouté à chaque lame et incubé à température ambiante pendant 30 min. Les sections ont ensuite été perméabilisées en les fixant pendant 15 min avec du Triton-X à 0, 1% dans du PBS à température ambiante. Pour empêcher la liaison des anticorps non spécifiques aux échantillons, 1 ml de solution de BSA à 3% a été ajouté aux lames et incubé pendant 1 h à température ambiante. La BSA a ensuite été jetée et les lames ont été lavées avec du PBS. À l'aide d'un stylo à cire, chaque échantillon a été marqué. Les anticorps primaires (dilution 1:200 dans 1% BSA) (Connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) et Troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960), ont été ajoutés à la section pendant 90 min, suivis des anticorps secondaires (dilution 1:200 dans 1% BSA) Anti-mouse Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; # A16079), Anti-lapin Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific ; #T6391) pendant encore 90 minutes séparées par trois lavages avec du PBS. Pour distinguer la coloration cible de l'arrière-plan, nous n'avons utilisé qu'un anticorps secondaire comme contrôle. Enfin, la coloration nucléaire DAPI a été ajoutée et les lames ont été montées dans du vectashield (Vector Laboratories) et scellées avec du vernis à ongles. L'imagerie par immunofluorescence a été réalisée à l'aide d'un imageur à haute teneur Cytation 1 (20 grossissement de lentille X) et un microscope Keyence utilisant un grossissement de lentille 40X.

Pour la coloration WGA, WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) a été utilisé à 5 µg/mL dans du PBS et a été appliqué sur des sections fixes pendant 30 min à température ambiante. Les lames ont ensuite été lavées avec du PBS, et du noir de Soudan a été ajouté à chaque lame et incubé pendant 30 min. Les lames ont ensuite été lavées avec du PBS et un milieu de montage vectashield a été ajouté. Les lames ont été imagées sur un microscope Keyence en utilisant un grossissement de lentille 40X.

L'OCT a été retiré des échantillons comme décrit ci-dessus. Une fois l'OCT retiré, les lames ont été immergées dans la solution de Bouin pendant une nuit. Les lames ont ensuite été rincées à l'eau distillée pendant 1 h, puis placées dans une solution Biebrich Scarlet-acide Fuchsine pendant 10 min. Les lames ont ensuite été lavées à l'eau distillée et placées dans une solution 5% phosphomolybdique/5% acide phosphotungstique pendant 10 min. Sans rinçage, les lames ont été directement transférées dans une solution de bleu d'aniline pendant 15 min. Ensuite, les lames ont été rincées à l'eau distillée et placées dans une solution d'acide acétique à 1% pendant 2 min. Les lames ont été séchées dans de l'alcool éthylique à 200 degrés et transférées dans du xylène. Les lames colorées ont été imagées à l'aide d'un microscope Keyence avec un grossissement de lentille de 10 ×. Le pourcentage de surface de fibrose a été quantifié à l'aide du logiciel Keyence Analyzer.

CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), catalogue # V13154, a été utilisé selon le protocole du fabricant avec quelques modifications. En détail, un poinçon chirurgical de 6 mm a été utilisé pour assurer une taille de tissu similaire lors de l'exécution du test MTT. Les tissus ont été placés chacun dans un puits de plaques 12 puits contenant du substrat MTT selon le protocole du fabricant. Les tranches ont été incubées pendant 3 h à 37 ° C et le tissu viable a métabolisé le substrat MTT créant un composé de formazan violet. La solution de MTT a été remplacée par 1 ml de DMSO et incubée à 37 ° C pendant 15 min pour extraire le formazan violet des tranches de cœur. Les échantillons ont été dilués à 1:10 dans du DMSO dans une plaque à 96 puits à fond transparent, et l'intensité de la couleur violette a été mesurée à l'aide d'un lecteur de plaque Cytation (BioTek) à 570 nm. Les lectures ont été normalisées au poids de chaque tranche de cœur.

Le milieu des tranches de cœur a été remplacé par un milieu de culture contenant 1 μCi/ml de [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) pour le test d'utilisation du glucose, comme décrit précédemment46,47. Après incubation pendant 4 h, 100 ul de milieu ont été ajoutés à un tube de microcentrifugeuse sans capuchon contenant 100 ul de HCl 0, 2 N. Ensuite, le tube a été placé dans un flacon à scintillation contenant 500 µl de dH2O pour permettre la diffusion par évaporation de [3H]2O à 37 °C pendant 72 h. Ensuite, les tubes de microcentrifugeuse ont été retirés des flacons de scintillation et 10 ml de liquide de scintillation ont été ajoutés. Le comptage de scintillation a été effectué à l'aide d'un analyseur de scintillation liquide Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). L'utilisation du glucose a ensuite été calculée, en tenant compte de l'activité spécifique du [5-3H]-glucose, de l'équilibrage incomplet et du bruit de fond, de la dilution du [5-3H] en glucose non marqué et de l'efficacité du compteur à scintillation. Les données ont été normalisées au poids des tranches de cœur.

L'ARN a été isolé des tranches de cœur à l'aide du kit Qiagen miRNeasy Micro, # 210874, en suivant le protocole du fabricant après homogénéisation des tissus dans du Trizol. La préparation, le séquençage et l'analyse des données de la bibliothèque RNAseq ont été effectués comme décrit ci-dessous :

1 μg d'ARN par échantillon a été utilisé comme matériau d'entrée pour les préparations de la bibliothèque d'ARN. Les bibliothèques de séquençage ont été générées à l'aide du kit de préparation de bibliothèque d'ARN NEBNext UltraTM pour Illumina (NEB, États-Unis) conformément aux recommandations du fabricant et des codes d'index ont été ajoutés pour attribuer des séquences à chaque échantillon. En bref, l'ARNm a été purifié à partir de l'ARN total en utilisant des billes magnétiques poly-T oligo-attachées. La fragmentation a été réalisée à l'aide de cations divalents à température élevée dans le tampon de réaction de synthèse NEBNext First Strand (5X). L'ADNc du premier brin a été synthétisé à l'aide d'une amorce hexamère aléatoire et de la transcriptase inverse M-MuLV (RNase H-). La synthèse d'ADNc du deuxième brin a ensuite été réalisée en utilisant l'ADN polymérase I et la RNase H. Les surplombs restants ont été convertis en extrémités franches via des activités exonucléase/polymérase. Après adénylation des extrémités 3 'des fragments d'ADN, les adaptateurs NEBNext avec une structure en boucle en épingle à cheveux ont été ligaturés pour préparer l'hybridation. Afin de sélectionner des fragments d'ADNc d'une longueur préférentielle de 150 à 200 pb, les fragments de la bibliothèque ont été purifiés avec le système AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Ensuite, 3 μl d'enzyme USER (NEB, USA) ont été utilisés avec de l'ADNc adapté à la taille et ligaturé à 37 ° C pendant 15 min, suivi de 5 min à 95 ° C avant la PCR. Ensuite, la PCR a été réalisée avec l'ADN polymérase Phusion High-Fidelity, les amorces Universal PCR et l'amorce Index (X). Enfin, les produits de PCR ont été purifiés (système AMPure XP) et la qualité de la bibliothèque a été évaluée sur le système Agilent Bioanalyzer 2100. Ensuite, les bibliothèques d'ADNc sont séquencées à l'aide du séquenceur Novaseq. Le fichier de données d'image original d'Illumina est transformé en lectures brutes par la reconnaissance de base CASAVA (Base Calling). Les données brutes sont stockées dans des fichiers au format FASTQ(fq), qui contiennent des séquences de lectures et la qualité de base correspondante. HISAT2 est sélectionné pour cartographier les lectures séquencées filtrées sur le génome de référence Sscrofa11.1. En général, HISAT2 prend en charge les génomes de toute taille, y compris ceux de plus de 4 milliards de bases et la plupart des paramètres sont définis par défaut. Les lectures épissées des données RNA Seq peuvent être efficacement alignées à l'aide de HISAT2, qui est le système le plus rapide actuellement disponible, avec une précision égale ou supérieure à toute autre méthode.

L'abondance du transcrit reflète directement le niveau d'expression des gènes. Le niveau d'expression génique est estimé par l'abondance de transcrits (nombre de séquençage) cartographiés au génome ou à l'exon. Le nombre de lectures est proportionnel au niveau d'expression du gène, à la longueur du gène et à la profondeur de séquençage. Les FPKM (fragments par kilobase de séquence de transcription par millions de paires de bases séquencées) ont été calculés et les valeurs P d'expression différentielle ont été déterminées à l'aide du package DESeq2. Ensuite, nous avons calculé les taux de fausses découvertes (FDR) pour chaque valeur P avec la méthode Benjamini-Hochberg 9 basée sur la fonction R intégrée "p.adjust".

L'ARN extrait des tranches de cœur a été converti en ADNc à une concentration de 200 ng/μl à l'aide du mélange SuperScript IV Vilo Master de Thermo (Thermo, Cat # 11756050). La qRT-PCR a été exécutée à l'aide d'une plaque de réaction optique transparente à 384 puits Applied Biosystems microamp Endura (Thermo, Cat # 4483319) avec un film adhésif optique microamp (Thermo, Cat # 4311971). Le mélange réactionnel est composé de 5 μl de Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, Cat # 4444557), 0,5 μl d'amorce Taqman et 3,5 μL de H2O par puits ont été mélangés. Le cycle de qPCR standard a été exécuté et les valeurs CT ont été mesurées à l'aide d'un instrument de PCR en temps réel Applied Biosystems Quantstudio 5 (bloc de 384 puits ; produit n° A28135). Les amorces Taqman ont été achetées auprès de Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA 4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1).Toutes les valeurs CT des échantillons ont été normalisées par rapport au gène domestique GAPDH.

La libération de NT-ProBNP dans les milieux de culture a été évaluée à l'aide d'un kit NT-ProBNP (porcs) (Cat # MBS2086979, MyBioSource) conformément au protocole du fabricant. En bref, 250 μL de chaque échantillon et standard ont été ajoutés à chaque puits en double. Immédiatement après l'ajout des échantillons, 50 µL de réactif de détection A ont été ajoutés par puits. La plaque a été secouée doucement et scellée avec un Plate Sealer. La plaque est ensuite incubée 1h à 37°C. Ensuite, la solution a été aspirée et les puits ont été lavés avec 350 μL de solution de lavage 1X 4 fois, en laissant la solution de lavage incuber pendant 1 à 2 minutes à chaque fois. Ensuite, 100 μL de réactif de détection B ont été ajoutés par cellule et scellés avec un scellant de plaque. La plaque a été agitée doucement et incubée à 37°C pendant 30 min. La solution a été aspirée et les puits ont été lavés avec 350 μL de solution de lavage 1X 5 fois. 90 μL de solution de substrat ont été ajoutés à chaque puits et la plaque a été scellée. La plaque a été incubée pendant 10-20 min à 37°C. 50 μL de solution d'arrêt ont été ajoutés par puits. La plaque a été immédiatement mesurée à l'aide d'un lecteur de plaque Cytation (BioTek) réglé à 450 nm.

Des analyses de puissance ont été effectuées pour choisir les tailles de groupe qui fourniront > 80 % de puissance pour détecter un changement absolu de 10 % dans le paramètre avec un taux d'erreur de type I de 5 %. Les tranches de tissu ont été choisies au hasard avant les expériences. Toutes les analyses ont été effectuées en aveugle en ce qui concerne les conditions et les échantillons n'ont été décodés qu'après l'analyse de toutes les données. Le logiciel GraphPad Prism (San Diego, CA) a été utilisé pour effectuer toutes les analyses statistiques. Pour toutes les statistiques, les valeurs de p ont été considérées comme significatives à des valeurs < 0,05. Des tests t de Student bilatéraux ont été effectués pour les données avec seulement 2 comparaisons de groupe. Une ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle a été utilisée pour déterminer la signification entre plusieurs groupes. La correction de Tukey a été appliquée pour tenir compte des comparaisons multiples lors de la réalisation de tests post hoc. Les données RNAseq avaient une considération statistique particulière pour calculer le FDR et le p.adjust, comme résumé dans la section des méthodes.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les auteurs déclarent que toutes les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article et ses fichiers d'informations supplémentaires. Veuillez consulter les données supplémentaires 1 fichier Excel pour les données RNAseq et les points de données pour chaque figure. De plus, les données brutes RNAseq sont déposées dans le référentiel GEO sous le numéro d'accession GSE211110.

Les auteurs déclarent que toutes les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article et ses fichiers d'informations supplémentaires. Le fichier de code de logiciel supplémentaire montre les codes informatiques utilisés dans les analyses. Le code logiciel a été déposé dans Zenodo44 : https://doi.org/10.5281/zenodo.7023518.

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Les auteurs tiennent à remercier les organismes de financement qui ont rendu ce travail possible : TMAM est soutenu par les subventions des NIH R01HL147921 et P30GM127607 et la subvention de l'American Heart Association 16SDG29950012. Les auteurs reconnaissent également les subventions du NIH F32HL149140 (RREA), P30GM127607 (BGH), R01HL130174 (BGH), R01HL147844 (BGH), R01ES028268 (BGH), P01HL78825 (RB, BGH), UM1HL113530 (RB) et 2U54HL120163. Nous remercions également le Département de la Défense des États-Unis d'Amérique pour la subvention W81XWH-20-1-0419 (TMAM).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Jessica M. Miller, Moustafa H. Meki.

De l'Institut de cardiologie moléculaire, Département de médecine, Université de Louisville, Louisville, États-Unis

Jessica M. Miller, Moustafa H. Meki, Qinghui Ou, Riham RE Abouleisa, Xian-Liang Tang, Abou Bakr M. Salama, Ahmad Gebreil, Cindy Lin, Roberto Bolli & Tamer MA Mohamed

Département de bioingénierie, Université de Louisville, Louisville, États-Unis

Jessica M. Miller, Moustafa H. Meki, Ahmed Elnakib, Hisham Abdeltawab, Fahmi Khalifa, Ayman S. El-Baz, Guruprasad A. Giridharan & Tamer MA Mohamed

Faculté de médecine, Université de Zagazig, Zagazig, Égypte

Abou Bakr M. Salama

Envirome Institute, Diabetes and Obesity Center, Department of Medicine, University of Louisville, Louisville, États-Unis

Bradford G. Hill et Tamer MA Mohamed

AnaBios Corporation, San Diego, États-Unis

Najah Abi-Gergès

Département de pharmacologie et de toxicologie, Université de Louisville, Louisville, États-Unis

Tamer MA Mohamed

Institut des sciences cardiovasculaires, Université de Manchester, Manchester, Royaume-Uni

Tamer MA Mohamed

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JMM et MHM : conception expérimentale, collecte et analyse de données moléculaires et cellulaires, rédaction du manuscrit et approbation finale du manuscrit ; AE : analyse de déformation effectuée ; QO : découpe, coloration et imagerie du cœur ; XL.T., RB : Collecte de cœurs de porc et rédaction manuscrite, RREA et BGH : Analyse métabolique ; AS, CL et AG : immunomarquage et coloration et analyse du trichrome ; HA, FK, NA et ASE : analyse de l'intelligence artificielle pour l'intégrité des tissus des tranches de cœur ; GG : Ingénierie de conception et supervision du CTCM et stimulation mécanique ; TMAM : conception et conception de l'ensemble des travaux, et financement assuré. Tous les auteurs ont contribué à la rédaction du manuscrit et à l'approbation finale du manuscrit.

Correspondance à Tamer MA Mohamed.

TMAM détient des actions chez Tenaya Therapeutics. GG consulte pour NuPulseCV. NA est le directeur scientifique et détient des actions d'Anabios. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Aida Oliván-Viguera et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Ngan Huang et Eve Rogers. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Miller, JM, Meki, MH, Elnakib, A. et al. Modèle de culture de tissu cardiaque biomimétique (CTCM) pour émuler la physiologie cardiaque et la physiopathologie ex vivo. Commun Biol 5, 934 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03919-3

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Reçu : 07 février 2022

Accepté : 30 août 2022

Publié: 09 septembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-03919-3

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